ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數(shù)均應認真負責才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應建立實驗項目的標準操作程序（SOP）。抗體

加樣

    加樣應用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
    每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。
樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。
    如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。

溫育
    抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經過一定的時間才能達到反應的平衡點
    ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
    邊緣效應（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結果）
洗滌
    ELISA是靠洗滌來達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。
手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液；2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。
    重復以上操作至少5次。注意各種ELISA試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
    洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。

顯色
    HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度， 一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止或根據(jù)臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間.

酶標儀判讀結果
    顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。
    常見的顯色系統(tǒng)有OPD和TMB二種，以后者zui為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。

    使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。抗體