體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，以1：2或1：3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，細(xì)胞倍增3～6次。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過(guò)j個(gè)階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。

一、材料

1．標(biāo)本80％或接近匯合成片的細(xì)胞。

2．試劑硝化液、PBS、培養(yǎng)液。

3．器具吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、*。

二、操作步驟

1．在超凈工作臺(tái)中吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液。

2．加入少許消化液，以液面覆滿平底為宜，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，消化液鋪滿所有細(xì)胞表面。

3．如果在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大，立即終止消化。

4．吸出消化液，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷，制成細(xì)胞懸液。

5．用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，用培養(yǎng)液調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。一般情況，傳代后的細(xì)胞在2h左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4d就可在瓶?jī)?nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。