通過使用免疫方法測定抗原和抗體間的結(jié)合，可以檢測出溶液中抗原和抗體的濃度。臨床實(shí)驗(yàn)室zui常用的免疫測定技術(shù)可以分為兩類。*類是敏感度相對來說不那么高的技術(shù)，它包括以光散射和凝膠沉淀為原理的方法，這些方法中，抗體和抗原結(jié)合后發(fā)生生物物理學(xué)變化，然后產(chǎn)生信號（如形成沉淀）。第二類技術(shù)包括RIA、EIA、熒光免疫測定和化學(xué)發(fā)光免疫測定，在檢測抗體與抗原間的結(jié)合時，這些方法需要用放射性核素，酶，熒光或能發(fā)光的分子修飾抗原或抗體試劑。不論哪一種技術(shù)，為定量檢測濃度而轉(zhuǎn)換結(jié)合信號時都要求使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線中，加的是已知量的反應(yīng)物。
使用光散射來檢測單克隆抗體與可溶性抗原的結(jié)合就說明了這個原理。6抗原和抗體在溶液中相互作用后形成分子復(fù)合物，該復(fù)合物比兩種反應(yīng)物的分子量都要大。光散射強(qiáng)度與分子量的平方成比例，7可以把抗原抗體復(fù)合物的形成描述為有更多的光散射，而不是由各蛋白質(zhì)產(chǎn)生的光散射的總和。例如，將含單克隆抗體的溶液放置于比濁計(jì)中，然后加入遞增量的抗原?？乖?抗體復(fù)合物產(chǎn)生光散射的增量比抗原抗體單獨(dú)產(chǎn)生的光散射要大。光散射圖的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在抗原與抗體的克分子濃度比等于2的地方。在這一點(diǎn)，抗體與抗原的反應(yīng)達(dá)到飽和，因?yàn)槊總€IgG抗體分子都有兩個結(jié)合位點(diǎn)。低于飽和點(diǎn)的任何一處，都有一個*的光散射信號與抗原濃度相對應(yīng)。用已知濃度的抗原溶液可以得到光散射信號的強(qiáng)度，進(jìn)而得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果檢測一個未知的標(biāo)本，產(chǎn)生一個光散射信號y，那么從標(biāo)準(zhǔn)曲線就可定義出抗原的濃度等于x。所有的定量免疫測定都遵循下列原則。那就是（1）抗原-抗體復(fù)合物的量與被結(jié)合的抗原量成比例，（2）信號（如光散射）與抗原抗體復(fù)合物的量成比例，（3）用已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)化信號，（4）用標(biāo)準(zhǔn)曲線把信號轉(zhuǎn)換成濃度檢測。

實(shí)踐中，本例描述的散射光信號很小以致于它僅用于檢測純化的單克隆抗體和純化的抗原之間的結(jié)合作用。血清中別的蛋白質(zhì)的散射光背景會掩蓋抗原-抗體復(fù)合物的散射光。抗體與抗原結(jié)合后會出現(xiàn)內(nèi)在的變化，因此，大多數(shù)以此為原理的免疫測定方法都會使用多克隆抗血清，并以抗原-抗體的沉淀反應(yīng)為原理。因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗原都有好幾個可以被抗體識別和結(jié)合的位點(diǎn)，大多數(shù)抗血清也含有好幾種可以識別同一抗原分子不同結(jié)構(gòu)的抗體。因此，在典型的抗原-抗體反應(yīng)中，一個單獨(dú)的抗原可以有很多的抗體結(jié)合到它的表面。由于每種抗體分子都有兩個結(jié)合位點(diǎn)，那么與*個抗原結(jié)合的抗體都可以再與另一個相同的抗原結(jié)合，而每個抗原分子又可能有許多的抗體與之結(jié)合。這種交叉結(jié)合（或交叉連接）的現(xiàn)象導(dǎo)致了大量的不可溶的抗原抗體復(fù)合物的形成，該復(fù)合物叫晶格。晶格的形成是由于抗體雙價的結(jié)合結(jié)構(gòu)以及抗原多結(jié)合位點(diǎn)的出現(xiàn)。抗原過量時，抗體被飽和，沒有足夠的抗體與復(fù)合物交叉連接?？贵w過量時，抗原被抗體飽和，沒有足夠的抗原與復(fù)合物交叉連接。使用單克隆抗體而不是多單克隆抗血清時，每個抗原只能與一個單獨(dú)的位點(diǎn)結(jié)合，不會有交叉連接（或晶格形成）出現(xiàn)。

沉淀反應(yīng)是zui早被描述的抗原抗體反應(yīng)之一。8.9可以在某種介質(zhì)如瓊脂里進(jìn)行反應(yīng)，瓊脂允許蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散或電泳但大的，不溶性的抗原-抗體復(fù)合物卻不行。以瓊脂為基礎(chǔ)，zui常用的定量免疫化學(xué)技術(shù)是放射免疫擴(kuò)散（RID）。10 RID是zui簡單可靠的免疫測定技術(shù)之一，但它也有有一些缺點(diǎn)。沉淀反應(yīng)發(fā)展緩慢，有時需要好幾天才能得出結(jié)果。單*個測定，能被分析的未知的東西很有限，且此技術(shù)相對來說靈敏度不是很高。進(jìn)行RID時，先在玻璃板上鋪一薄層瓊脂，整個瓊脂內(nèi)均勻地含有溶解的抗體試劑。在瓊脂*打一小孔，孔里放置（標(biāo)準(zhǔn)或未知的）抗原，接著抗原在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，形成一個濃度梯度。抗原在瓊脂內(nèi)移動時，被抗體結(jié)合，但在孔附近的抗原過量帶，抗原-抗體復(fù)合物仍保持可溶。抗原和抗原-抗體復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)散，直到等價帶中有足夠的抗體被結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物晶格。等價帶中形成的沉淀在含抗原的孔周圍形成環(huán)狀。標(biāo)本中抗原濃度越高，等價帶中需要的抗體越多，沉淀環(huán)的直徑越大。沉淀環(huán)的平方（即面積）與抗原的濃度成正比。

典型的RID測定是：把抗體加入到融化的瓊脂中，然后把瓊脂倒在一玻璃載玻片上，讓它凝固。在凝膠中打孔，各孔中分別加入未知標(biāo)本和一系列已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)物。將載玻片置于濕的溫箱中孵育30分鐘到2小時，然后就可以測定沉淀環(huán)的直徑。RID不需要特殊儀器，臨床上許多小的實(shí)驗(yàn)室都使用該技術(shù)。

也可用比濁法來對沉淀反應(yīng)進(jìn)行定量。比濁法比凝膠技術(shù)更敏感、更快速，且能自動化。如前邊所提到的，比濁法檢測的是被散射的光，散射光的強(qiáng)度與溶液形成的抗原-抗體復(fù)合物的分子量的平方成比例。在終點(diǎn)（平衡）比濁法中，抗原和抗體孵育30分鐘到2小時，測定散射光，將它和標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，該標(biāo)準(zhǔn)曲線上的散射光與抗原濃度相對應(yīng)。在速率比濁法中，抗原與抗體混合后，在很短的一段時間內(nèi)，立即檢測多個散射光，通過這樣，可以測定出抗原-抗體復(fù)合物形成的起始速率。散射光形成的速率越快，表明抗原抗體復(fù)合物形成的速率越快和抗原的濃度越高。比濁免疫分析法快速、可靠、容易實(shí)現(xiàn)自動化。利用商業(yè)提供的設(shè)備和抗體試劑，許多蛋白質(zhì)都可以在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測。自動化的比濁法也可用于血清Igs(包括IgE),白蛋白,C3,C4,轉(zhuǎn)鐵蛋白, α1抗*,C反應(yīng)蛋白,C1 酯酶抑制因子的定量檢測;尿液中肌球蛋白和白蛋白水平的測定;以及脊柱液中IgG和白蛋白水平的檢測。
第二類免疫測定需要用一種“通訊群體"對反應(yīng)物（抗原或抗體）中的一個進(jìn)行修飾。放射性核素，酶，熒光染料或發(fā)光的分子都可用做出現(xiàn)了抗體結(jié)合抗原的信號。這些方法在技術(shù)上實(shí)施起來更困難，但它們都是必要的，因?yàn)樯飿?biāo)本中微量（ng/ml）抗原或抗體的檢測和定量都要求更高的靈敏度。zui先描述RIA的原理是1960年胰島素的測定，而且這門技術(shù)是靈敏度zui高的技術(shù)之一。11 典型的競爭性替代RIA中：先放射性標(biāo)記抗原，然后將標(biāo)記抗原與抗體一起孵育，再把與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原與未結(jié)合的抗原分離，zui后檢測已結(jié)合的放射性活度。如果在加入標(biāo)記抗原的同時也加未標(biāo)記的抗原，未標(biāo)記抗原就會競爭有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，與被提供的抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原就變少。試管里含固定量的標(biāo)記抗原和抗體，如果往里加入遞增濃度的未標(biāo)記抗原，就可構(gòu)建一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這種方法叫競爭替代法因?yàn)?a data-cke-saved-href="http://m.hg1112.cn/st154696/list_643464.html" href="http://m.hg1112.cn/st154696/list_643464.html">抗體試劑的量不足以結(jié)合所有標(biāo)記和未標(biāo)記的抗原分子。做這個實(shí)驗(yàn)時，臨床醫(yī)生一定要有特異性的抗血清或單克隆抗體，純化的放射性標(biāo)記的抗原，純化的未標(biāo)記的抗原標(biāo)準(zhǔn)物，以及分離結(jié)合跟游離抗原的方法。多數(shù)RIAs都是用125I放射活性通訊群體，用γ閃爍記數(shù)儀檢測發(fā)出的放射性活度。由于具有敏銳的分析靈敏度，RIAs的用處很大，但由于放射性核素的使用，它們的放置時間又很短。zui常見的分離技術(shù)是使用第二抗體，該抗體能跟*抗體反應(yīng)形成沉淀。已結(jié)合的放射性標(biāo)記的抗原跟復(fù)合物一起沉淀下來，通過離心分離結(jié)合和游離的放射性活度。zui近，已設(shè)計(jì)出一些使用固相結(jié)合抗體的方法。這些方法中，抗體結(jié)合于固相表面，如試管內(nèi)壁或聚苯乙烯珠粒。往試管里加入標(biāo)準(zhǔn)或未知抗原以及放射性標(biāo)記抗原后，通過簡單地傾倒試管或移走珠粒就可分離結(jié)合和游離抗原。

固相結(jié)合抗體的使用引致了“三文治"免疫測定的發(fā)展，也叫兩位點(diǎn)免疫測定方法（IMAs）。在這一類型的方法中，臨床醫(yī)生純化和放射性標(biāo)記第二抗體而不是標(biāo)記純化的抗原。*抗體與固相結(jié)合，然后加入抗原，zui后通過加入放射性標(biāo)記的第二抗體，該抗體也能與抗原結(jié)合，就可以檢測與固相結(jié)合的抗原。隨著更高濃度的的抗原標(biāo)準(zhǔn)物的加入，更多的標(biāo)記抗體與固相結(jié)合，從而形成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。免疫放射測定（IRMA）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記的是純化的抗體而不是純化的抗原?？贵w是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分子，容易被放射性核素、酶和能發(fā)光的分子標(biāo)記上。但有些抗原在化學(xué)標(biāo)記過程中卻有可能被改變或遭到破壞。

如前所述，兩位點(diǎn)IMA的基本原理是可以使用多種通訊群體。也就是說，除了使用放射性核素標(biāo)記的第二抗體，第二抗體還可與酶或發(fā)光分子結(jié)合，然后用分光光度計(jì)或發(fā)光計(jì)而不是用γ閃爍記數(shù)儀來定量檢測結(jié)合抗體。如果用的是酶標(biāo)記，該方法叫EIA。典型的EIA是通過加入底物溶液來定量檢測已結(jié)合的酶連第二抗體，該底物被酶水解后顏色發(fā)生改變。因此，加入到試管里的抗原越多，被結(jié)合的酶連二抗也越多，同時，在給定的時間內(nèi)，顏色強(qiáng)度的變化也越大。許多EIAs都用微量滴定板進(jìn)行，然后用自動分光光度計(jì)定量，該分光光度計(jì)能直接讀取多孔板的吸光度。EIAs有好幾個優(yōu)點(diǎn)：不使用同位素，試劑有較長的放置時間，沒有廢物處置問題。三文治EIA方法的分析靈敏度與競爭性替代RIA相近。