免疫組化染色前處理技術操作規(guī)范

1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多數實驗室都認為組織在加熱抗原修復過程中造成脫片的主要原因是取材過厚或脫水浸蠟處理不當所致。良好的取材、固定、脫水過程是免疫組化質控的前提，如果H&E切片都做不出滿意的染色結果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質量。

2、固定：在眾多的組織固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的實驗方法在使用上各有千秋。但在保持組織細胞結構的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價格上，福爾馬林是、既經濟又通用。而含酸或含汞的固定液對抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過30分鐘，在常溫條件下固定時間為8-24小時。同時還要注意避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原丟失，有研究發(fā)現新鮮組織經過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴重，抗原幾乎不能被檢測，因為組織固定后會引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯，導致抗原位點遮蓋，可以通過抗原修復方法來修正，若加抗體前不采用抗原修復，則免疫組化染色常不能到達理想結果或不成功。組織同樣不能長時間放置在70%的乙醇中，酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對抗原破壞較為嚴重，因此在組織脫鈣前在福爾馬林液中固定48小時，若組織沒有固定透則酸會破壞抗原，脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時間都必須盡量控制在zui低的限度。

3、浸蠟：我們認為浸蠟溫度應控制在58~60℃左右，浸蠟用的石蠟應經常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細胞收縮，更容易掉片。

4、切片厚度：用于免疫組織化學染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過程中脫片，需要使用硅化玻片裱片。

5、硅化玻片的制備：載玻片經酸洗沖洗干凈后烤干； 2%APES丙酮或*中浸泡1~2min；丙酮或*洗1~2分鐘；蒸餾水浸洗1~2min；烤干備用。

6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右。有些實驗室采用烤片過夜。有報導烤片溫度超過60℃時，烤片時間超過18小時的切片，免疫組化染色強度比烤4小時的切片要略弱。溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。

7、切片保存：一些實驗室研究人員習慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。邁新實驗室在實驗中發(fā)現蠟塊切片后，在室溫下保存三個月以上，免疫組化染色結果會出現減弱或陰性情況。并進行了新、舊切片的保存時間對照實驗，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個月、三個月、半年、一年與新切片進行成對對照實驗。實驗結果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個月，抗原對多數抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數的抗體不能出現陽性標記結果，保存一年以上僅有個別的切片能夠有微弱的陽性表達，尤其核表達的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關，所以在實際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中實驗的切片更應注意切片的保存。

8、脫蠟：免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實驗室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟*，否則可能導致染色結果的異常。