(一)試驗(yàn)原理

    葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括細(xì)胞膜、胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體等。胰島素和某些降血糖藥對該系統(tǒng)具有激活作用，可促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)節(jié)糖代謝。本實(shí)驗(yàn)通過離體睹肪細(xì)胞與2一脫氧一3 H一葡萄糖或3一O一3 H一甲基葡萄糖溫孵，檢測脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取情況，觀察待測藥物對其影響。

(二)材料

1．待檢藥物進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋。

2．陽性對照藥胰島素。

3．動(dòng)物140～200g SD或Wistar雄性大鼠1只。

4．試劑及配制

(1)鹽貯存液：稱取NaCl 76．74 g，KCl3．51g．MgSC4·7 H20 3．63 g，CaCl2·2H2O3．63 g，溶于1000ml蒸餾水中，4℃保存(2周)。

(2)HEPES貯存液：稱取HEPES 23．8g，NaH2PO4·H2O 42g，溶于1000ml蒸餾水中，pH調(diào)至7．6(20℃)，4℃保存(2周)。

(3)10%白蛋白貯存液：稱取100g白蛋白(Ⅱ、Ⅷ型)，溶于500ml蒸餾水中，放置過夜后透析12 h(4℃)，加水至1000ml。用濾紙過濾1次后，用O．8μm微孔濾器再次過濾·應(yīng)使溶液保持低溫。pH調(diào)至7，4，分裝后一20℃可存放1年以上。

(4)緩沖液：1：10鹽貯存液、l：10 HEPES貯存液、一定量白蛋白貯存液(0．5％～5％)，蒸餾水加至終體積。

(5)膠原酶緩沖液：膠原酶(Ⅱ、Ⅷ型)緩沖液含O．5mmol／L葡萄糖、3．5％BSA．濃
度為0．5 mg／ml，pH調(diào)至7．4(37℃)，一20℃可存放4周。

5．器材37℃水浴箱、電磁攪拌器、50ml塑料燒杯、300μm尼龍篩、圓底塑料試管。

(三)實(shí)驗(yàn)方法

1．脂肪細(xì)胞的分離與制備

(1)斷頭處死大鼠后打開腹腔，取附睪脂肪墊，將脂肪墊用剪刀剪成I～2 min。大小置于含3ml膠原酶緩沖液(溫度不低于25℃)的燒杯中。

(2)燒杯在30℃水浴溫孵450min左右，低速攪拌l～2 min，使90％組織分散。

(3)將300μm尼龍篩折成漏斗狀，置于圓底試管上，倒人細(xì)胞后用少量緩沖液沖洗。靜置細(xì)胞l～2 min后，用長針頭吸取試管底部的細(xì)胞碎片，加入10ml緩沖液后輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管，去除下沉物，重復(fù)該過程3～4次。

(4)量取濃縮的脂肪細(xì)胞懸液，用緩沖液稀釋到相應(yīng)濃度。

(5)用顯微鏡檢查制備好的脂肪細(xì)胞。將5μl脂肪細(xì)胞懸液稀釋25～50倍后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小測量，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106／ml亦可采用鋨酸固定后的細(xì)胞。

2．藥物對細(xì)胞毒性的測定(藥物無毒*的選擇) 采用微量培養(yǎng)法。預(yù)先將上述細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃5％CO2孵箱內(nèi)，大約24h細(xì)胞成層后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。再將遞倍稀釋(1：2，1：4…1：512)的0．1ml受檢藥物，分別加入成層的HeLa細(xì)胞孔內(nèi)，每孔再補(bǔ)加O．1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度4孔，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照孔，置37℃5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每天記錄細(xì)胞病變結(jié)果，直至藥物對細(xì)胞的毒性不再繼續(xù)進(jìn)展時(shí)判定結(jié)果，以不出現(xiàn)細(xì)胞病變的藥物zui小稀釋倍數(shù)為無毒*，計(jì)算出受檢藥的無毒*。

3．葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的測定取2～4×106個(gè)／800gl脂肪細(xì)胞置于培養(yǎng)管中，37℃水浴溫孵：用生理鹽水將胰島素或待測藥物從無毒*開始稀釋成不同濃度，取4～8ul加到上述細(xì)胞懸液中。溫孵30～60min后，加80μl 2一脫氧一3 H一葡萄糖(1．22×105Bq／μmol)，使其終濃度為100μmol／L，溫孵3min。取200μl懸液，加入100“l鄰苯二甲酸二辛酯后，8500r／min離心20s，分離油相細(xì)胞層，加5ml閃爍液后計(jì)數(shù)。

    細(xì)胞外放射性沾染的排除：將L一[14C]葡萄糖加入脂肪細(xì)胞懸液中，4℃放置3min。離心后取油相細(xì)胞計(jì)數(shù)，校正后數(shù)值即為脂肪細(xì)胞對2一脫氧葡萄糖的攝取值。

(四)結(jié)果與分析

1．胰島素和某砦藥物可直接促進(jìn)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2．有些藥物對葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)無直接作用，但與低濃度胰島素(≤1nmol／L)共同孵育，可增強(qiáng)胰島素促進(jìn)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取作用。

3．非代謝的葡萄糖類似物3-O-3 H一甲基葡萄糖與脂肪細(xì)胞溫浴后，用快速過濾法亦可測定脂肪細(xì)胞對葡萄糖的攝取。