免疫熒光組織化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術測定含量。

    用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學分直接法、間接法和補體法。

1、直接法

（1） 檢查抗原方法

    這是zui簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，制成特異性熒光抗體，直接用于細胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。

（2）檢查抗體方法

    將抗原標記上熒光素，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體在原位檢測出來。

2、間接法

（1）檢查抗體（夾心法）方法

    此法是先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。

（2）檢查抗體方法

    用已知抗原細胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結合在抗原上的抗體反應，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。

（3）檢查抗原法

    此法是直接法的重要改進，先用特異性抗體與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體與結合在抗原上的抗體結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于同一種屬產生的多種*抗體的標記顯示，這是現(xiàn)在zui廣泛應用的技術。

3、補體法

（1）直接檢查組織內免疫復合物方法

    用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原-抗體-補體—抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復合物上補體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。

（2）間接檢查組織內抗原方法

    常將新鮮補體與*抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育后，如發(fā)生抗原抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原-抗體-補體—熒光抗體的復合物，此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的*抗體的檢查。

4、雙重免疫熒光組織化學標記方法

    在同一組織標本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。