質粒載體的改造

⑴去掉不必要的DNA區(qū)段。細胞

⑵減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。

⑶加入易于撿出的選擇性標記基因。

⑷對質粒進行安全性改造，要求質粒不能隨便 轉移。

⑸改造或增加基因表達的調(diào)控序列。

1、質粒pBR322

結構：

（1）氨芐*抗性基因（ampr或Apr）

內(nèi)部有3種限制酶單一識別位點 。

（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）

內(nèi)部有7種，啟動區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識別位點 。

（3）DNA復制起點（ori）

pBR322質粒的優(yōu)點：

（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。

（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過*擴增之后,每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。

（4）對多種常見的限制性內(nèi)切核酸酶只含有一個能切割的位點。

2、pUC質粒載體

1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術在pBR322基礎上構建的。

結構：

（1）來自于pBR322的Ori

（2）氨芐*的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化

（3） LacZ′基因

編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈即氨基末端。

（4）MCS區(qū)段

是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個載體中是*的。

與pBR322相比， pUC質粒載體優(yōu)點：

（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp，控制質粒復制rop基因的缺失，平均每個細胞即可達500～700個拷貝

（2）適用于組織化學法檢測重組體

通過a-互補作用，利用菌落顏色篩選重組子。

（3）具有多克隆位點區(qū)段（MCS）

可以定向克隆防止載體自我連接。