一、實(shí)驗(yàn)試劑
1、碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM)
2、PBS
3、封閉液
4、洗滌液
5、抗體稀釋緩沖液
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 包被抗原
1) 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀釋抗原到 PVC 酶標(biāo)板上的*排孔，按要求往后進(jìn)行系列稀釋。
2) 酶標(biāo)板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時(shí)，或者 4 °C 過(guò)夜。孵育時(shí)間需要優(yōu)化。
3) 倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標(biāo)板除去殘留液體。
2. 封閉
1) 用含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標(biāo)板上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，每孔加 200 μl。也可用其他封閉劑如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。
2) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫至少孵育 2 小時(shí)，或者 4 °C 過(guò)夜。
3) PBS 洗板 2 次。
3. 加一抗和二抗進(jìn)行孵育
1) 每孔加入 100 μl 稀釋好的一抗。
2) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫孵育 2 小時(shí)，孵育時(shí)間需要進(jìn)行優(yōu)化。通常 2 小時(shí)孵育即可獲得足夠強(qiáng)的信號(hào)，但如果獲得的信號(hào)較弱時(shí)，可4 °C 孵育過(guò)夜獲得較強(qiáng)信號(hào)。
3) PBS 洗板 4 次。
4) 加標(biāo)記二抗，每孔 100 μl。稀釋到zui合適的濃度（參照說(shuō)明書），使用前用封閉液現(xiàn)配。
5) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫孵育 1-2 小時(shí)。
6) PBS 洗板 4 次。
4. 檢測(cè)
1) 用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。
2) 顯示出足夠深的顏色后，加終止液每孔 100 μl（如有必要）。
3) 酶標(biāo)儀讀取吸光度值（光密度）。
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