(一)原代培養(yǎng)法

.將新生大鼠用頸椎脫位法處死，去除足趾及尾巴。70％酒精消毒后固定于解剖板上。

2.去除后腿皮膚，用血管鉗分離并剪切大腿肌肉。用含抗生素(00IU／ml、00μg／ml)的PBS沖洗2次。

3.將肌肉組織放人裝有用D—Hanks液配制的0．25％的溶液瓶中。瓶中預(yù)先放人一個磁棒，37℃(或室溫)磁力攪拌器上消化多次，每次0min。

4.利用沉淀法收集上清液中懸浮的細胞，未消化部分可繼續(xù)用同樣方法消化。

5.向細胞懸液中加入終濃度為0%的馬血清，終止消化作用。2500~3000r／min離心3~5min，用少量的培養(yǎng)液重新懸浮細胞，鋼網(wǎng)過濾細胞懸液。

6.計數(shù)懸液細胞數(shù)。調(diào)制細胞濃度為 X 06／ml。

7.接種細胞時，按60mm培養(yǎng)皿接種2～3×06細胞數(shù)為宜。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

(二)骨骼肌細胞純化

    骨骼肌細胞的貼壁速度比非肌源性細胞慢，為此，可以用差速貼壁法獲得較高純度的肌源性細胞。具體方法是：

.取原代培養(yǎng)早期的細胞(培養(yǎng)30~40h)，經(jīng)洗滌后，用0．25%的溶液消化。細胞開始脫壁時以馬血清終止消化。

2．收集脫壁的細胞，洗滌后用培養(yǎng)液制備成細胞懸液。

3．立即接種到另一培養(yǎng)板上，貼壁40min。此時，多數(shù)非肌源性細胞已經(jīng)貼壁，而骨骼肌細胞仍懸浮在培養(yǎng)液中，或沉降到培養(yǎng)板上但未貼壁。

4．吸出未貼壁細胞，計數(shù)后將細胞調(diào)至所需細胞濃度，進行接種。

5．接種后，骨骼肌細胞純度可達到90％以上。該方法亦可用于直接經(jīng)溶液消化的肌肉組織細胞。

(三)骨骼肌細胞的克隆化培養(yǎng)

．明膠處理培養(yǎng)皿，將明膠覆蓋于培養(yǎng)皿一層即可。

2．制備飼養(yǎng)細胞將飼養(yǎng)細胞(可為鼠傳代細胞，或其他細胞)經(jīng)60GyX線照射后，以0．5～l×05個／皿鋪于培養(yǎng)皿。

3．將原代或傳代培養(yǎng)的骨骼肌細胞計數(shù)并進行有限稀釋，每培養(yǎng)皿接種25～00個細胞。在適宜的條件下，細胞增殖一代的時間為～3h。一般在培養(yǎng)3～6d開始形成克隆。在無飼養(yǎng)層細胞時亦可形成克隆，但易受培養(yǎng)條件影響而降低克隆形成率。

4．單一克隆分離及傳代，先以蠟筆標記出顯微鏡下觀察到的克隆，吸去培養(yǎng)液，以克隆環(huán)套住克隆并以硅脂封閉。向環(huán)中加l滴0．25％溶液。數(shù)分鐘后吸出細胞懸液，接種到新的培養(yǎng)板上。從原代培養(yǎng)的細胞獲得的克隆通?？蓚鳌?代，但肌源性細胞株則易于進行連續(xù)傳代，可克隆多次。

三、結(jié)果觀察

    在接種后數(shù)小時，多數(shù)細胞即可貼附至培養(yǎng)瓶(皿)。培養(yǎng)瓶中主要應(yīng)為單個核的肌細胞．梭形、折光性較強可與非肌源性細胞相鑒別。接種培養(yǎng)約50h后，可見明顯細胞融合，并能形成纖維網(wǎng)。數(shù)天后細胞融合停止。融合后ld可見肌纖維的自發(fā)性收縮，l～2d后骨骼肌細胞的特征性橫紋變得明顯。利用放射自顯影、細胞化學(xué)及生物化學(xué)等方法可分析與融合有關(guān)的細胞合成活動的變化。

四、冷凍保存

    骨骼肌細胞也可以用冷凍保存的方式保種。

．將肌細胞消化后配成約06個／ml的細胞懸液，用含20％馬血清，2％DMSO的細胞培養(yǎng)液配制，每個2ml的凍存管中加入lml細胞懸液，做好標記。

2．先將凍存管置于4℃數(shù)小時，放于一20℃數(shù)小時。放在經(jīng)4℃預(yù)冷的壁厚lcm以上的泡沫塑料盒內(nèi)，置于80℃低溫冰箱中，使凍存管達到緩慢制冷的效果。l～2d后．可將凍存管放人液氮中保存。

3．解凍時，將凍存管從液氮罐中取出，立即放人37℃水浴中迅速解凍。臺式離心機離心500 r／min。然后吸去上清液，以新鮮培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，接種培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。也可不離心，直接將細胞懸液接種至培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。細胞貼壁后可按常復(fù)方法換液。