、 鮭魚傳染性貧血病毒（ISAV）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒簡介
貨號：HB-705-
鮭魚傳染性貧血癥, 英文名: Infectious Salmon Anaemia,簡稱 ISA。它的主要癥狀是嚴(yán)重貧
血，受感染后的鮭魚大約在 2-3 周后死亡。不同的鮭魚對 ISA 病毒有不同的敏感性，主要體征表現(xiàn)
為魚眼球突出，腹腔積水，腹部器官出血，有時也會發(fā)生在皮膚上。肝臟或腎臟局部組織死亡。癥
狀的特征是貧血、腹水、脾腫大和在眼、皮膚和腹膜出血。實驗已經(jīng)證明，虹鱒，褐鱒魚和鮭魚可
能是 ISA 病毒無癥狀攜帶者。
為了適應(yīng)鮭魚傳染性貧血癥病毒（ISAV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考 205 年 OIE
水生動物疾病診斷手冊 2.3.5 中規(guī)定的引物和探針序列，經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)了本試
劑盒。應(yīng)用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢
測等特點及優(yōu)點。
2、 試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 ：
表 ：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
核酸提取試劑： 核酸裂解液 5ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
ISAV 熒光 RT-PCR 反應(yīng)液
酶混合物
陰性對照
ISAV 熒光陽性對照
ml× 管
750µL× 管
60µL× 管
ml× 管
ml× 管
（注：核酸提取試劑可使用本公司的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）
3、 樣本采集,存放及運輸
3. 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS混勻，2 000r/min 離心 0min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用?；蛉∮锌梢杉毎∽兊募毎麘乙河糜跈z測。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；-70 ℃以下可保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。4、 熒光 RT-PCR 檢測
4. 操作方法
4.. 樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）：
4... 取 n 個滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性
對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。
(注：試劑盒中的陽性對照直接作為一步法RT-PCR檢測的模板，無需提取核酸)
4...2 每管加入 600 µL 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 µL，一份樣本換用一個吸
頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用
手顛倒混勻），于 4℃ 2 000 r/min 離心 5 min。
4...3 取與 4... 相同數(shù)量滅菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 異丙醇（-20℃預(yù)冷），
做標(biāo)記。吸取 4...2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500µL，不能吸
出中間層，顛倒混勻。
4...4 于 4 ℃、2 000 r/min 離心 5 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4...5 于 4 ℃、2 000 r/min 離心 0 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4...6 4 000 r/min 離心 0s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4...7 加入 µL DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增；若需保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
4..2 鮭魚傳染性貧血病毒（ISAV）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒檢測
4..2. 擴增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。
設(shè)所需熒光 RT-PCR 檢測總數(shù)為 n，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣品測試反應(yīng)體系配制見表 2：
表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 酶混合物
用量 5 μL .0 μL
根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個熒光RT-PCR管中各分裝6 µL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
4..2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4...7中制備的RNA溶液各0 µL，蓋緊管蓋，500 r/min離心30 s。4..2.3 熒光 RT-PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
將4..2.2中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，反轉(zhuǎn)錄42 o
C /30 min；
第二階段，預(yù)變性92 o
C/3 min；
第三階段，92 o
C/0s，60 o
C/30s，72 o
C/20s，40個循環(huán)，在第三階段每次循環(huán)的60 o
C退火延
伸時收集熒光。
試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。
4.2 結(jié)果判定
4.2. 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的zui高點為準(zhǔn)。
4.2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
4.2.2. 陰性對照的 Ct 值應(yīng)<28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
4.2.3 結(jié)果描述及判定
4.2.3. 陰性
無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無ISAV核酸。
4.2.3.2 陽性
Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在ISAV核酸。
4.2.3.3 有效原則
Ct值>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
5、 鮭魚傳染性貧血病毒（ISAV）熒光 RT-PCR 檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息（引物和探針序列）
5’-CTA-CAC-AGC-AGG-ATG-CAG-ATG-T-3’
5’-CAG-GAT-GCC-GGA-AGT-CGA-T-3’
5’-6FAM-CAT-CGT-CGC-TGC-AGT-TC-MGBNFQ-3’
