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上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
中級(jí)會(huì)員·17年您現(xiàn)在的位置： 首頁(yè)> 技術(shù)文章 > 實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)丨競(jìng)爭(zhēng)性ELISA：受體蛋白包被濃度及配體蛋白-Tag飽和濃度的確定
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勁馬是一家業(yè)經(jīng)營(yíng)生物試劑、科研儀器、生物試劑、實(shí)驗(yàn)耗材的公司，主要經(jīng)營(yíng)ELISA試劑盒，血清，抗體，標(biāo)準(zhǔn)品，生物試劑，實(shí)驗(yàn)耗材，培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)外包等，產(chǎn)品暢銷國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)，覆蓋面廣，產(chǎn)品齊全，價(jià)格實(shí)惠，服務(wù)周到。我司擁有雄厚的實(shí)力、合理的價(jià)格和完善的服務(wù)，能夠及時(shí)解決和滿足客戶的各方面的需求，與國(guó)內(nèi)多家企業(yè)建立了良好的長(zhǎng)期合作關(guān)系，在市場(chǎng)上樹立了公司的良好信譽(yù)和形象。
01
·Tag飽和濃度的確定：
1. 包被：用1×包被液將受體蛋白稀釋若干個(gè)濃度（如2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL），每孔加入100µL包被液，4℃包被過夜（確定最佳包被濃度）；
2. 洗滌：棄去（或回收）板內(nèi)液體，用PBST洗滌液（0.05%吐溫20）每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干；
3. 封閉：加入封閉液（1%BSA溶液），每孔200 µL，保鮮膜包裹酶標(biāo)板，放置于37℃水浴鍋中，水浴1h；
4. 配制配體蛋白-Tag溶液：用樣品稀釋液將配體蛋白-Tag稀釋至1 µg/mL（稀釋液為0.5% BSA），3倍系列稀釋，共10個(gè)梯度（封閉結(jié)束前半小時(shí)，防止樣品變質(zhì)）；
5. 加樣：每孔加入100 µL配制好的配體蛋白-Tag溶液，保鮮膜包裹后，放置于37℃水浴鍋中水浴2h；
6. 洗滌：棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干。
7. 加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀釋液為0.5% BSA），37℃水浴鍋中水浴1.5 h；
8. 洗滌：棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌5次，拍干；
9. 顯色：每孔加入100µl顯色液（TMB），顯色15 min；
10. 終止：每孔加入50 µL 10%硫酸終止；
11. 檢測(cè)：酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450和OD630的吸光度值。
注：最終依據(jù)擬合的濃度-吸光度曲線，確定合適的受體蛋白包被濃度，并且同時(shí)確定該包被濃度下的配體蛋白飽和濃度。
02
1. 用先前確定的最佳的受體蛋白包被濃度包被板子，同上述條件洗滌，封閉；
2. 配置不同起始濃度的待測(cè)抗體：用樣品稀釋液將待測(cè)抗體稀釋若干個(gè)濃度（如80 µg/mL、40 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL），再將上述稀釋液進(jìn)行3倍稀釋，共10個(gè)梯度（封閉結(jié)束前半小時(shí)，防止樣品變質(zhì)）；
3. 在受體蛋白包被板中加入2倍飽和濃度的配體蛋白-Tag溶液，每孔50 µL，立即加入50 µL系列稀釋的待測(cè)抗體，保鮮膜包裹后，放置于37℃水浴鍋中水浴2h；
4. 洗滌：棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌3次，拍干。
5. 加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 µL二抗溶液（稀釋液為0.5% BSA），37℃水浴鍋中水浴1.5 h；
6. 洗滌：棄去板內(nèi)液體，用PBST洗滌液每孔200µL，每次洗滌3min，洗滌5次，拍干；
7. 顯色：每孔加入100µL顯色液（TMB），顯色15 min；
8. 終止：每孔加入50 µL 10%硫酸終止；
9. 檢測(cè)：酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450和OD630的吸光度值。
總結(jié)
ELISA實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室十分常規(guī)的檢測(cè)手段，總體操作難度不大，但由于操作步驟繁多，且結(jié)果較為靈敏，容易出現(xiàn)結(jié)果差異較大的現(xiàn)象，因此需要格外注意上樣的順序及加樣量，以保證盡可能縮小誤差。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA較普通ELISA實(shí)驗(yàn)額外多出一個(gè)實(shí)驗(yàn)組分，需要在開展正式實(shí)驗(yàn)之前盡可能多摸索幾個(gè)各個(gè)組分的工作濃度，以保證最終的結(jié)果在較好的范圍內(nèi)呈現(xiàn)。
