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高質(zhì)量的組蛋白PTM抗體
點擊次數(shù)：1039 發(fā)布時間：2013-8-30
美國芝加哥大學(xué)的研究人員開發(fā)出質(zhì)量穩(wěn)定的重組抗體，能特異識別組蛋白H3的*基賴氨酸殘基，適合各種表觀遺傳學(xué)應(yīng)用。這一成果于近日發(fā)表在《Nature Methods》在線版上。
組蛋白的翻譯后修飾（PTM）在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用。組蛋白PTM的抗體是表觀遺傳學(xué)研究（如染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、免疫染色和免疫印跡）中的關(guān)鍵元素。然而，許多抗體不能特異識別預(yù)定目標。此外，目前的組蛋白抗體以多克隆抗體居多，因此每一批抗體都是不同的產(chǎn)品，在使用前需要廣泛驗證。
事實上，組蛋白的翻譯后修飾是挑戰(zhàn)性的抗體識別靶點，因為各個修飾之間的化學(xué)差異很小，特別是甲基化狀態(tài)之間，并且不同修飾位點周圍的序列相似度高。而且，很難實現(xiàn)與靈活肽段的高親和力，如組蛋白的尾巴，因為結(jié)合時會有熵損失。因此，難以產(chǎn)生高質(zhì)量的抗體并不出人意料。
為了解決這一“抗體瓶頸”，芝加哥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系的研究人員開始了他們的探索。他們首先發(fā)現(xiàn)了一個單鏈Fc克隆（scFv4-5），它能高度特異地與*基賴氨酸結(jié)合，但親和力和序列特異性低。為了改善結(jié)合功能，他們利用突變法鑒定出對識別*基賴氨酸很重要的位置。隨后利用突變數(shù)據(jù)設(shè)計出定制的噬菌體展示庫，并根據(jù)結(jié)合情況排序。他們發(fā)現(xiàn)了一個克?。?09M3-A），與H3K9me3的解離常數(shù)為24 nM，與scFv4-5相比有80倍的改善，而且?guī)缀醪慌c其他肽段結(jié)合，展示出高親和力和高特異性。它的批間差異也很小。
除了H3K9me3的抗體，研究人員還開發(fā)出H3K4me3的抗體。這個克隆被稱為304M3-A，與H3K4me3的解離常數(shù)為16 nM，且特異性高，批間差異小。
由于ChIP可以說是組蛋白PTM抗體的zui重要應(yīng)用，研究人員在ChIP實驗中檢驗了這些重組抗體。結(jié)果表明，利用309M3-A和304M3-A的實驗分別富集了帶有H3K9me3和H3K4me3的特定位點。相比之下，陰性對照抗體未富集到任一位點，說明了抗體結(jié)合的低背景。
作者認為，重組抗體的可再生性質(zhì)讓研究人員不再需要評估每個抗體。重組抗體也能改造成不同的形式，適用于特定應(yīng)用。總之，組蛋白翻譯后修飾的重組抗體不僅大大加速并改善了表觀遺傳學(xué)研究，還有望實現(xiàn)新的研究。