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單個噬菌體在石蠟包埋的組織上進(jìn)行免疫組化
點(diǎn)擊次數(shù)：1033 發(fā)布時間：2010-8-14
[器材和試劑]
● 裝滿10m1冷的新配制的4％多聚甲醛（PFA）的10m1塑料注射器，并附有1英寸（2．54cm）、25號針頭（每只鼠一個）
● 為每只鼠準(zhǔn)備兩只*
● 為每份器官或組織準(zhǔn)備一個6cm的組織培養(yǎng)皿
● 1．25％（w/v）的阿佛丁水溶液
● 109～lOlO TU或pfu的噬菌體溶液
● 100％的無水乙醇
● 石蠟和自動*（automated tissue processor）（Tissue-Tek VIP；Miles ScientiFIc）
● 3％（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫（H202）的PBS溶液
● 1×PBS
● MilliQ水
● *（Zymed）
● fd一抗：兔抗fd的多克隆IgG（Sigma）
● T7一抗：兔抗T7的多克隆IgG（Ruoslahti Lab）
● fd和T7的二抗：羊抗兔IgG—HRP（DAKO Corporation）
●． DAKO抗體稀釋液[含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（carrier protein）和0．015mol/L NaN3的Tris—HCl緩沖液]
● DAB[3，3，—二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物（DAKO）]底物溶液。首先將6mg DAB溶于10ml pH為7．5的50mmol/ LTris—HCl溶液。然后將0．1ml的3％H202溶于其中，如果有任何形式的沉淀就進(jìn)行過濾。溶液必須在配制后的兩小時內(nèi)使用
[方法]
A．噬菌體的注射以及組織的制備
1．通過腹腔注射300～500ul的1．25％（w/v）阿佛丁來麻醉小鼠。
2．將鼠尾置于溫水中，使尾部血管膨脹。
3．用另外的*注射200g1的噬菌體溶液。
4．讓噬菌體循環(huán)至少5分鐘。
5．打開胸腔并暴露心臟。
6．用10～20m1冷的新配制的4％PFA來灌注動物。
7．將大塊的器官或腫瘤取出并切成小塊，并把它們浸泡于4％PFA中。在PFA中固定的時間不能超過24小時。
8．在一臺自動*（Tissue—Tek VIP；Miles Scientific） 中處理組織。
9．用石蠟包埋樣品并切成5um的切片。
B．抗原的獲取與封閉
1．用3％（體積分?jǐn)?shù)）的過氧化氫（H202）PBS溶液在室溫下孵育15分鐘，以除去內(nèi)源性過氧化物酶活性。用lXPBS洗滌兩次。
2．用*（ZymedLaboratories，Inc．）在37℃消化10分鐘來暴露抗原位點(diǎn)。用lXPBS
洗滌3次。
3．用抗*蛋白（avidin）/*（biotin）封閉試劑盒（Vecto rLaboratories）來封閉內(nèi)源性抗*蛋白和*的活性。
4．如果使用DAKO抗體稀釋液，則不需進(jìn)行蛋白封閉。
C．抗體和復(fù)染
1．用DAKO抗體稀釋液來稀釋一抗（對于多抗比例為1：1000），并添加約100ul到切片中（足夠*覆蓋切片的量）。在宅溫下孵育1小時，用1XPBS洗滌切片兩次。
2．向切片中添加大約100/11（足夠*覆蓋切片的量）的預(yù)先稀釋的多克隆二抗。在室溫下孵育30分鐘，用1×PBS洗滌切片兩次。
3．向切片中添加100gl的DAB底物溶液，并在室溫下孵育4～6分鐘。
4．用Harris蘇木精（Surgipath）在室溫下復(fù)染3分鐘，用自來水洗滌一次，脫水并用丙烯酸樹脂組織切片固定劑（mounting media）（Cytoseal 60；EMS）封片。