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Histochemical detection重組質(zhì)體的檢定
點擊次數(shù)：449 發(fā)布時間：2010-11-24
操作原理與colony hybridization 相同，但是將濾膜移置于含有IPTG 及5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide （X-Gluc） 的培養(yǎng)基。 X-Gluc 可被GUS作用而釋出藍(lán)色的產(chǎn)物，若轉(zhuǎn)型株所帶的質(zhì)體接有gus 基因的重組質(zhì)體，則應(yīng)可在IPTG 的誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出蛋白質(zhì)，若此重組蛋白質(zhì)具有GUS 活性，可將進(jìn)入菌體的X-Gluc 分解而使菌落呈藍(lán)色。
儀器用具：
平端鑷子
藥品試劑：
Nitrocellulose 濾膜
LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate （LB plate 添加100 μg/mL ampicillin, 0.2 M IPTG,
50 μg/mL X-Gluc）
方法步驟：
1） 前一天進(jìn)行轉(zhuǎn)形的培養(yǎng)皿，當(dāng)菌落長至約0.5 mm 大小時，將培養(yǎng)皿移至4℃放置至少1 h。
2） 準(zhǔn)備一張無菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標(biāo)上組別。
◆ 請戴手套后再拿取濾膜！
3） 打開培養(yǎng)皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產(chǎn)生。
◆ 注意！濾膜覆蓋上去后就不要再移動！
4） 等濾膜*濕透后，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號 （至少做三個記號）。 小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG/X-Gluc plate 上。蓋上蓋子，在37℃培養(yǎng)，若轉(zhuǎn)形株帶有接上gus 的質(zhì)體，菌落應(yīng)在1~2 h 內(nèi)轉(zhuǎn)呈藍(lán)色。原培養(yǎng)皿則置回37℃使菌落再長出。
5） 將濾膜與原培養(yǎng)皿對照，標(biāo)出有藍(lán)色菌落位置。 選取數(shù)個菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在LB/Amp/plate 上，置37℃直至菌落長出。 亦同時接種于3 mL LB/Amp 培養(yǎng)液，于37℃震蕩培養(yǎng)過夜，以抽取質(zhì)體，進(jìn)行限制酶分析。