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構(gòu)建輕鏈改組文庫
點擊次數(shù)：558 發(fā)布時間：2010-11-24
為便于輕鏈改組，要在FHENl—Vλ3載體中構(gòu)建輕鏈基因文庫。此載體以pHEN1為基礎(chǔ)并包含：pelB前導(dǎo)序列、1個NcoI克隆位點、1個多接頭、1個編碼VH框架4中2個C末端氨基酸的XhoI克隆位點、接頭DNA以及1個單條Vλ輕鏈。XhoI位點可編碼于VHFR4末端，但不會改變102和103（*—*）殘基的氨基酸序列。為了文庫構(gòu)建，采用PCR擴增Vκ和Vλ基因文庫以及接頭DNA。所用模板來自同樣的文庫容為1．8Χ108的scFv噬菌體抗體文庫。使用4個反向引物；它可以互補結(jié)合（G1y4Ser），接頭起始的6個核苷酸和JH1，2、JH3、JH4，5或JH6片段中任何1個，并含有XhoI克隆位點。用XhoI和NotI消化pHENl—Vλ3載體，除去單個的Vλ3基因，并將擴增的基因文庫克隆到消化的載體中。
zui終所產(chǎn)生的基因文庫包含重排的人Vκ和Vλ基因文庫、接頭DNA以及1個作為NcoI—XhoI片段插入重排VH基因的克隆位點。
用改組的VL鏈構(gòu)建scFv基因文庫的策略。
（a）用PCR在載體pHENl中構(gòu)建輕鏈文庫。（b）再將作為Nco I—XhoI片段的重排VH基因插入．構(gòu)建VL改組文庫
為創(chuàng)建輕鏈改組文庫，以PCR擴增來自起始scFv的重排VH基因，引物采用互補結(jié)合VH基因上游的BACK引物以及互補結(jié)合目標scFv的JH基因。載體pHENl中scPv基因的構(gòu)建過程中分別使用了引物I-MB3和引物scFvJHXho—FOR中的1條。LMB3互補結(jié)合pHENl中PelB前導(dǎo)序列上游，scFVJHXhoFOR互補結(jié)合目標scFv的JH基因。下面所述的試劑部分列出的4條ＪHFOR引物中應(yīng)有一條與特定的scFvVH基因*匹配，這也正是應(yīng)當(dāng)使用的FOR引物。如果起始scFv的克隆載體不足pHENl而是其他的，那么需要一條不同的5’端引物。