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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：823發(fā)布時間：2010-8-23
對熒光定量PCR結果的分析方法我們分為兩種：定量分析法和相對定量分析法。
1、定量分析方法，起始濃度的對數(shù)跟循環(huán)數(shù)的線性關系，標準曲線由已知拷貝數(shù)的標準品繪制，根據(jù)樣品的Ct值，可求樣品的模板量。
（1）標準品的制備：
1V的樣品原液（i）+9V稀釋緩沖液，得到ii；
1Ｖ的ii +9V稀釋緩沖液，得到iii；
1V的iii + 9V稀釋緩沖液，得到iv；
1V的iv +9V稀釋緩沖液，得到v。
（2）拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）=OD260×40*稀釋倍數(shù)
樣品分子量+堿基數(shù)×324
待測樣本拷貝數(shù)=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014
從擴增數(shù)據(jù)得到循環(huán)數(shù)，通過標準曲線，我們可以求出樣品的拷貝數(shù)。
2.相對定量分析方法：
其又可有雙標準曲線法和雙Ct法。所謂相對，就只是實驗前后結果的對比，反映了反應前后的數(shù)據(jù)的差值。
（1）雙標準曲線法，分析簡單，但是對于每一個基因，每一輪實驗都需要做標準曲線，而且必須有特定的標準品作標準曲線，這樣的標準品不代表樣品擴增的真實狀態(tài)。這種方法常用于基因表達調(diào)控。
Ｆ＝待測樣品目的基因濃度/待測樣品參照基因濃度÷對照樣品目的基因濃度/對照樣品參照基因濃度
（2）雙Ct法，此方法不用對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需要對待測樣品分別進行ＰＣＲ擴增即可，標準曲線的差值＜０．１．假若擴增效率為１００％或標準曲線及每次擴增之間的效率都保持一致，這樣實驗條件優(yōu)化較難為復雜。這種分析方法較長用于基因表達調(diào)控研究中。
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