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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：693發(fā)布時(shí)間：2010-10-9
一種在抗體—微珠基質(zhì)上快速捕獲抗原的方法是將抗原溶液與微珠混合，旋轉(zhuǎn)或振蕩制成勻漿。這種方法可使抗原和固相化的抗體之間zui大限度地接觸，是一種促使結(jié)合反應(yīng)快速完成的方法。結(jié)合反應(yīng)完成后，將勻漿裝入層析柱內(nèi)以便收集微珠和洗脫抗原。此法可以很好地控制反應(yīng)時(shí)間，使基質(zhì)上的抗體結(jié)合容量達(dá)到zui充分的利用。這比以上介紹直接用層析柱捕獲抗原的方法稍微麻煩一些。主要是因?yàn)閷驖{裝柱比較困難；另一個(gè)問題是在混勻過程中會(huì)增加抗原溶液中變性蛋白的量，所以使用這種方法的本底可能較高。
1．準(zhǔn)備工作
在開始工作前，要考慮裝填微珠的層析柱的類型及大小。如果微珠的柱床體積寬而淺，洗脫的峰形比較清晰，而且比較容易回收，將其貯存于另一個(gè)容器中供下次使用。層析柱太粗的缺點(diǎn)是在更換洗脫緩沖液時(shí)會(huì)擾動(dòng)影響微珠。
2．所需溶液和特殊設(shè)備
結(jié)合緩沖液（通常為PBS）；
搖床；簡(jiǎn)便的層析設(shè)備。
3．操作步驟
（1）將抗體—微珠基質(zhì)加入抗原制品內(nèi)。所加微珠的體積應(yīng)通過預(yù)備試驗(yàn)確定，調(diào)整微珠的用量，使其結(jié)合反應(yīng)所需時(shí)間內(nèi)剛好能將所有的抗體分離。微珠的zui終濃度大約為lml濕珠加到10—20ml緩沖液中。
（2）4C孵育微珠—抗原勻漿，并輕輕混合。常用的方法是在一封閉的容器中振蕩或置平板搖床上渦旋混勻。孵育時(shí)間根據(jù)步驟（1）的預(yù)備試驗(yàn)確定。開始試驗(yàn)時(shí)可以先孵育2h。
（3）將微珠勻漿轉(zhuǎn)移到一個(gè)大小合適的層析柱中。將勻漿倒入柱內(nèi)，并用抗原緩沖液洗下混合容器中殘留的微珠，將洗滌液一道加入柱內(nèi)。
（4）用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗滌微珠。
此時(shí)制備好的層析柱可進(jìn)行進(jìn)一步洗滌或洗脫。
4．常見問題
這種方法zui大的問題是蛋白質(zhì)非特異地結(jié)合到微珠上。這些蛋白可在洗脫時(shí)出現(xiàn)，從而使純化效率降低?；|(zhì)本身和抗體—基質(zhì)復(fù)合物表面都可以非特異地結(jié)合抗原溶液中的蛋白質(zhì)，盡管這些反應(yīng)一般要比抗體—抗原間的反應(yīng)弱，但在起始的抗原制品中如會(huì)有過量的非特異性蛋白就意味著在分離過程中將產(chǎn)生內(nèi)在的高本底。以下幾種方法可使非特異性結(jié)合降到zui低限度。
首先，如同其他親和純化法一樣，所用基質(zhì)的量必須調(diào)整到剛好在其飽和水平之上。保持抗體—微珠基質(zhì)的用量，使非特異性本底盡可能降低。微珠的用量可通過預(yù)試確定，并監(jiān)測(cè)不同體積的抗體—微珠基質(zhì)所獲得的抗原量。
第二種方法是降低柱上的非特異性吸附量。許多吸附到柱基質(zhì)上的蛋白質(zhì)是部分或全部變性的蛋白。在制備抗原溶液時(shí)，機(jī)械性用力要盡可能輕。在結(jié)合階段，用機(jī)械振動(dòng)使微珠保持混懸狀時(shí)，動(dòng)作亦應(yīng)盡可能輕，并避免過度與空氣接觸。另一種非特異性吸附來自某些異常的小碎片，在將微珠轉(zhuǎn)移到柱中后，可被柱基質(zhì)截留。在將抗原溶液加入微珠之前，先將抗原溶液經(jīng)過100 000g離心30min，可去除制品中大的凝聚物。
第三種降低本底的方法是在裝好柱后用緩沖液洗滌微珠，以去除非特異性蛋白。任何不干擾抗原抗體反應(yīng)的緩沖液都可以用于消除非特異性結(jié)合。詳見表9．5洗滌緩沖液的應(yīng)用。
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