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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：402發(fā)布時間：2011-7-23
雙向電泳，關鍵在于建立一套有效、可重復的樣品制備方法。方法是多種多樣的，不過都基本遵循以下的原則：
1. 樣品緩沖液中離子濃度的控制
2. 溶解包括疏水蛋白在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)
3. 防止聚焦過程中已溶解蛋白質(zhì)的聚焦和析出
4. 防止樣品制備過程中及其后蛋白樣品的酶或化學降解等的修飾反應
5. 去除或*降解核酸及其他干擾分子
6. 去除高豐度或不相關的蛋白質(zhì)，提高低豐度蛋白的濃度，使其達到檢測要求
提高分辨率和確保重復性是雙向電泳實驗zui重要的兩個目標。蛋白樣品制備在實現(xiàn)這兩個目標的過程中起到了核心作用。Bio-Rad公司的ReadyPrep試劑盒通過試劑增溶或差異溶解來減少脫尾或降低樣品復雜性，從而成為用戶可靠的實驗工具。ReadyPrep 產(chǎn)品線包含一系列2-D 樣品制備試劑盒，不僅適用于通用樣品（總蛋白）處理，而且可以將復雜樣品按特定方法分級。處理通用樣品的試劑盒包括總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級試劑盒可用來降低樣品復雜程度，同時有助于低豐度蛋白的富集和鑒定。這類試劑盒又分為兩種，一種是基于蛋白不同的亞細胞定位來分離，另一種是對細胞總蛋白進行分級，從而適合于總蛋白質(zhì)組分析。
從血清或血漿中提取的低豐度蛋白經(jīng)常會受到白蛋白和IgG的干擾。白蛋白在血清總蛋白中的含量約為60-70%，IgG雖小，也不可輕視，占了總蛋白的約10-20%。這兩種蛋白異軍突起，常常掩蓋了其它類似大小的蛋白，使我們無視低豐度蛋白的存在，也降低了雙向電泳的分辨率。因此，在分析目的蛋白之前，我們一定要先干掉白蛋白和IgG這兩個家伙。
樣品中的核酸會對等電聚焦的結果產(chǎn)生干擾：DNA復合物在變性條件下發(fā)生解離而使溶液的粘稠度增加，可阻礙蛋白質(zhì)進入IPG膠條，并減慢蛋白質(zhì)在膠條中的移動速度。DNA也會與樣品中的某些蛋白質(zhì)結合，出現(xiàn)人工假象和條紋。
具體的解決方案如下：
去除鹽分、去垢劑、脂類、酚類
ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒
ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒可去除蛋白樣品中的去垢劑、鹽分、小肽、脂類和酚類化合物。這些物質(zhì)會干擾雙向電泳。本試劑盒含有不受去垢劑、離液劑或其它實驗中常用試劑干擾的沉淀試劑，可充分沉淀樣品蛋白，并保證了蛋白樣品的回收效率和濃度。
去除白蛋白
Aurum Affi–Gel 藍膠小型試劑盒和層析柱
通過親和層析，Affi–Gel 藍膠能去除血清和血漿中90%的白蛋白。
去除白蛋白/IgG
Aurum 血清蛋白Mini試劑盒
Aurum 血清蛋白Mini試劑盒包含了Micro Bio-Spin層析柱，其中填充了Affi-Gel 藍膠和Affi-Gel Protein A填料。這兩種樹脂混合物能同時選擇性地結合白蛋白和IgG，處理過的樣品無需額外純化，就能立即用于2D的分析。一次純化就能搞定兩個東西，操作步驟減少了，效率也提高了。
去除DNA
zui簡單的方法就是酶解。當樣品用高pH溶液裂解后，在溶液中加入核酸內(nèi)切酶，既能有效降解核酸，又能使內(nèi)源性蛋白酶的活性zui低。也可以在冰浴環(huán)境中，通過超聲處理的方法將大片段的核酸打斷成小片段后，直接進行雙向電泳。
總蛋白抽提
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白）
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （總蛋白） 是一種操作簡單、快捷、重復性好的試劑盒，用來抽提適合于雙向電泳的細胞全蛋白。試劑盒中離液性*的抽提溶液含有兼性去垢劑ASB-14，從而使該溶液能溶解各種細胞的全蛋白。
根據(jù)亞細胞定位分步抽提
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒 （膜I）
本試劑盒是利用Triton X-114在一定溫度下可與水相分層的原理將蛋白分離。經(jīng)過zui后一步的離心步驟，溶液被分級成上層的水相和下層的高去垢劑相。此外還有一些難溶的沉淀，這些沉淀主要是更加復雜的膜蛋白。進入上下兩相的蛋白再用ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒（含在本試劑盒中）凈化，以去除抽提過程中混入的可能干擾IEF的物質(zhì)。
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒 （膜II）
膜II試劑盒做為其它膜蛋白分離試劑盒的補充，是專門為有效分離較為復雜的膜蛋白而優(yōu)化的。抽提的過程用到了碳酸鈉和超速離心機。試劑盒中的2-D水化/上樣緩沖液含有強離液性的兼性去垢劑ASB-14。
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒（信號）
絕大多數(shù)細胞的胞漿膜都有富含神經(jīng)鞘磷脂和*的微區(qū)域（酯筏）。與這些脂筏相的蛋白往往是參與物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運或信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)。這類蛋白包括GPI錨訂蛋白、caveolin、caveolae （caveolin-associated proteins）、?；?激酶、G蛋白異三聚體，以及一些含跨膜結構域的蛋白 （Simons and Ikonen 1997, Brown and Rose 1992, Parton and Simons 1995, Anderson et al. 1992） 。與胞膜當中這些富含酯類的微區(qū)域相結合的蛋白質(zhì)在4°C Triton X-100的溶液中難溶。ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒（信號） 利用這一原理將信號蛋白有選擇性地加以回收。
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）
ReadyPrep蛋白抽提試劑盒（胞漿/核）使用一種專門配制的緩沖液和差速離心將細胞核完整地分離出來（Dignam et al. 1983, Zerivitz and Akusjarvi 1989）。本試劑盒包含一種強離液性的緩沖液，可有效溶解膜蛋白，并可直接用于雙向電泳分離。如要對胞漿組分進行分析可以將蛋白樣品先用試劑盒中帶的ReadyPrep 2-D 凈化試劑盒處理。
根據(jù)不同的溶解度分步抽提
ReadyPrep 順序抽提試劑盒
ReadyPrep 順序抽提試劑盒是為全蛋白質(zhì)組分析而設計的。本試劑盒將初始蛋白樣品根據(jù)溶解性的不同分成三個組分。當?shù)鞍椎膩喖毎ㄎ徊荒艽_定時，本試劑盒還可以用來搜尋特定的蛋白。 依照溶液溶蛋白能力的增加將蛋白樣品進行順序抽提可以溶解更多的蛋白，從而使蛋白質(zhì)組的信息更全面。
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶）
ReadyPrep 蛋白抽提試劑盒 （可溶/不可溶） 可將細胞全部蛋白分為兩個組分——以親水性蛋白為主的可溶性組分和以疏水性蛋白為主的不可溶組分。這種簡單的分級方法可有效降低樣品的復雜性，提高低豐度蛋白的檢測效率，從而在總體上改善總蛋白質(zhì)組的分離效果。
保持蛋白的還原狀態(tài)
ReadyPrep還原/烷化試劑盒
ReadyPrep還原/烷化試劑盒首先將半*殘基之間的二硫鍵還原，然后將還原出來的巰基烷化，使得這些基團*保持還原狀態(tài)。這樣做有助于防止假蛋白點的出現(xiàn)并能讓IPG膠條中更多的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到第二向的SDS-PAGE膠中。本試劑盒對分析堿性蛋白質(zhì)特別有效。因為膠條堿性部位的DTT容易電離，在電場作用下遷移出IPG膠條，從而使膠條中DTT減少，蛋白質(zhì)二硫鍵重新形成。絕大多數(shù)生物含有較多數(shù)量的堿性蛋白，這類蛋白的pI值高于pH 7。
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