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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：326發(fā)布時間：2011-9-21
培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 新生兒臍帶 由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬*醫(yī)院提供。在無菌條件下，于健康產(chǎn)婦分娩后立即取新生胎兒臍帶。長度>20 cm，兩端扎緊投入到4℃臍帶保存液中，1 h內(nèi)送細(xì)胞培養(yǎng)室。
1．1．2 儀器與試劑倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺（蘇州凈化儀器廠）；5％C02培養(yǎng)箱（美國Heraeus公司）；離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；25cm2培養(yǎng)瓶、六孔培養(yǎng)板（美國CA）star公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；促內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物（ECGS）、M199培養(yǎng)基、I型膠原酶（美國Sigrna公司）；明膠、*（美國A1Tlresco公司）；滅菌生理鹽水（錦州醫(yī)學(xué)院附屬*醫(yī)院制劑室）；鼠抗人Ⅷ因子單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。
1．2 方法
1．2．1 試劑配制 ：（1）臍帶保存液：生理鹽水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml*一100 U／m1*。（2）磷酸鹽緩沖液（PBs）。（3）D—Hanks液。（4）0．1％ I型膠原酶：用PBS配制。（5）0．05％*一0．02％ 乙二胺四乙酸二鈉鹽（ED—TA）溶液：用D—Hanks液配制。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1*一100 U／m1*的M199培養(yǎng)基。（7）0．2％ 明膠：用PBS配制。以上試劑均過濾除菌。
1．2．2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)： 參照J(rèn)affe 和Lin S等方法并加以改進(jìn)。在無菌條件下取新生胎兒臍帶，長度>20 cm。剪去臍帶兩端和臍帶上有夾痕及血腫部分，盡量擠干凈臍帶內(nèi)血液。用生理鹽水沖洗臍帶表面至無血色。用*內(nèi)接有*的軟管，找到臍靜脈，將軟管針頭一端插入臍靜脈，用止水夾固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反復(fù)沖洗臍靜脈直至無血色液體流出為止；將臍帶另一端用*夾閉，向臍靜脈中灌入0．1％ I型*，使之充盈，夾閉軟管，37℃水浴中孵育20 min，其間輕輕擠壓并旋轉(zhuǎn)臍帶，以使酶溶液充分接觸血管內(nèi)壁，然后將細(xì)胞一酶溶液收集于預(yù)先裝有溫培養(yǎng)液小三角瓶中。用2倍于消化液的溫PBS沖洗臍靜脈，一并收集于小三角瓶中，將細(xì)胞懸液裝入10 ml離心管，1 000 r／min離心10 min，棄上清，吹打懸浮，再次離心10 min，重懸細(xì)胞并接種于鋪有明膠的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5％ C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2 d換液1次。
1．2．3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代細(xì)胞融合80％以上后，加入0．05％ *一0．02％EDTA 溶液消化，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞皺縮變圓、彼此分離時棄消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞懸液。1 000 r／min離心10 min，棄上清，制成單細(xì)胞懸液。此時可用0．5％臺盼藍(lán)染色，計算活細(xì)胞百分率，并以*計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10 個／ml，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿，彼此融合成片時依上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
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