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上海酶聯(lián)生物研究所

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亞“G1”峰檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

閱讀：405發(fā)布時(shí)間：2011-10-26

處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后，用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜，使細(xì)胞原有的DNA部分丟失，僅剩下大片段DNA，這些細(xì)胞在DNA染色后，用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)其DNA含量，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)DNA含量＜2n（即＜G1期細(xì)胞的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。
【樣品來源】
（1）懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞；
（2）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)*消化后的細(xì)胞懸液；
（3）離體細(xì)胞懸液。
將樣品分組，即空白對(duì)照組（未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）和實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）。
【材料與試劑】
（1）PBS緩沖液；
（2）70％酒精；
（3）DNA抽提緩沖液：取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ，與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合，調(diào)整pH到7.8；
（4）DNA染液：取200μg PI溶于10ml PBS，加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。
【操作步驟】
（1）1～5×106 個(gè)細(xì)胞，用70％酒精固定（-20冰箱），2h以上；
（2）洗滌：離心，棄去酒精，細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中，再離心，棄去上清；
（3）DNA片段抽提：將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS，加入1ml DNA抽提緩沖液，混勻，室溫下靜置5min，離心，棄去上清；
（4）DNA染色：將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液，室溫下避光染色30min；
（5）流式細(xì)胞儀測(cè)定：選用波長(zhǎng)488nm 藍(lán)色激發(fā)光，同時(shí)測(cè)定紅色熒光和前向角散射光；每例樣品測(cè)定5000～10000個(gè)細(xì)胞。
注：所有離心步驟均為1000r/min，5min。
【結(jié)果分析】
實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）的 DNA 組方圖上，在G1峰前出現(xiàn)一個(gè)呈高斯分布的峰（亞“G1”峰），分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比；空白對(duì)照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰，或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生，但其百分比不超過5％；發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰，但可出現(xiàn)一個(gè)連續(xù)的DNA小片段分布曲線，以此可與凋亡區(qū)分開來。
處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后，用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜，使細(xì)胞原有的DNA部分丟失，僅剩下大片段DNA，這些細(xì)胞在DNA染色后，用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)其DNA含量，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)DNA含量＜2n（即＜G1期細(xì)胞的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。
【樣品來源】
（1）懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞；
（2）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)*消化后的細(xì)胞懸液；
（3）離體細(xì)胞懸液。
將樣品分組，即空白對(duì)照組（未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）和實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）。
【材料與試劑】
（1）PBS緩沖液；
（2）70％酒精；
（3）DNA抽提緩沖液：取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ，與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合，調(diào)整pH到7.8；
（4）DNA染液：取200μg PI溶于10ml PBS，加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。
【操作步驟】
（1）1～5×106 個(gè)細(xì)胞，用70％酒精固定（-20冰箱），2h以上；
（2）洗滌：離心，棄去酒精，細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中，再離心，棄去上清；
（3）DNA片段抽提：將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS，加入1ml DNA抽提緩沖液，混勻，室溫下靜置5min，離心，棄去上清；
（4）DNA染色：將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液，室溫下避光染色30min；
（5）流式細(xì)胞儀測(cè)定：選用波長(zhǎng)488nm 藍(lán)色激發(fā)光，同時(shí)測(cè)定紅色熒光和前向角散射光；每例樣品測(cè)定5000～10000個(gè)細(xì)胞。
注：所有離心步驟均為1000r/min，5min。
【結(jié)果分析】
實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）的 DNA 組方圖上，在G1峰前出現(xiàn)一個(gè)呈高斯分布的峰（亞“G1”峰），分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比；空白對(duì)照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰，或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生，但其百分比不超過5％；發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰，但可出現(xiàn)一個(gè)連續(xù)的DNA小片段分布曲線，以此可與凋亡區(qū)分開來。
處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后，用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜，使細(xì)胞原有的DNA部分丟失，僅剩下大片段DNA，這些細(xì)胞在DNA染色后，用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)其DNA含量，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)DNA含量＜2n（即＜G1期細(xì)胞的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。因此處于“亞G1峰”的細(xì)胞代表樣品中的凋亡細(xì)胞。
【樣品來源】
（1）懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞；
（2）貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)*消化后的細(xì)胞懸液；
（3）離體細(xì)胞懸液。
將樣品分組，即空白對(duì)照組（未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）和實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）。
【材料與試劑】
（1）PBS緩沖液；
（2）70％酒精；
（3）DNA抽提緩沖液：取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ，與8ml 0.1mol/L枸櫞酸混合，調(diào)整pH到7.8；
（4）DNA染液：取200μg PI溶于10ml PBS，加入2mg無DNA酶活性的RNA酶。
【操作步驟】
（1）1～5×106 個(gè)細(xì)胞，用70％酒精固定（-20冰箱），2h以上；
（2）洗滌：離心，棄去酒精，細(xì)胞重新懸浮于10ml PBS中，再離心，棄去上清；
（3）DNA片段抽提：將細(xì)胞重新懸浮于0.5ml PBS，加入1ml DNA抽提緩沖液，混勻，室溫下靜置5min，離心，棄去上清；
（4）DNA染色：將細(xì)胞重新懸浮于1ml DNA染液，室溫下避光染色30min；
（5）流式細(xì)胞儀測(cè)定：選用波長(zhǎng)488nm 藍(lán)色激發(fā)光，同時(shí)測(cè)定紅色熒光和前向角散射光；每例樣品測(cè)定5000～10000個(gè)細(xì)胞。
注：所有離心步驟均為1000r/min，5min。
【結(jié)果分析】
實(shí)驗(yàn)組（經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理組）的 DNA 組方圖上，在G1峰前出現(xiàn)一個(gè)呈高斯分布的峰（亞“G1”峰），分析峰的百分比即可得出凋亡細(xì)胞的百分比；空白對(duì)照組因無凋亡發(fā)生而不出現(xiàn)亞“G1”峰，或有些細(xì)胞系可有自發(fā)性細(xì)胞凋亡發(fā)生，但其百分比不超過5％；發(fā)生壞死的細(xì)胞或機(jī)械性損傷之細(xì)胞在G1峰前不出現(xiàn)呈高斯分布的亞“G1”峰，但可出現(xiàn)一個(gè)連續(xù)的DNA小片段分布曲線，以此可與凋亡區(qū)分開來。

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