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技術(shù)文章

核酸凝膠電泳觀察法

閱讀：514發(fā)布時(shí)間：2011-11-2

實(shí)驗(yàn)原理：瓊脂糖是海藻中提取的線狀高聚物，不同濃度的瓊脂糖密度不同，一般PCR產(chǎn)物使用2%濃度，0.5Kb-10Kb的DNA使用1%濃度，基因組DNA使用0.3%-0.7%濃度；不同大小的核酸在同一濃度的凝膠中遷移率不同，因?yàn)榉肿釉酱笃涫墉傊堑淖枇υ酱?，遷移率與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)值成反比；同分子量不同構(gòu)象的核酸遷移率也不同，超螺旋環(huán)狀DNA遷移率>線狀DNA遷移率>帶切口環(huán)狀DNA遷移率。

熒光染料溴化乙錠可嵌入DNA堆積堿基間，DNA吸收的254nm的紫外輻射與溴化乙錠在302nm和366nm處的光吸收可在590nm處（可見光紅橙區(qū)）發(fā)光，利于觀察，用于核酸凝膠鑒定。

一、實(shí)驗(yàn)材料

瓊脂糖、溴化乙錠（10mg/ml）、6×loading buffer、凝膠電泳緩沖液（1×TAE或0.5×TBE）、電泳儀、電泳槽、微波爐

50×TAE（儲(chǔ)存液）： 242g/L Tris堿

57.1ml/L 冰乙酸

100ml/L 0.5M EDTA （PH 8.0）

6×loading buffer：0.25% 溴酚蘭

0.25% 二甲苯青FF

15%聚蔗糖（Ficoll 400型）（pharmacia）

瓊脂糖（promega）

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．配置凝膠電泳緩沖液，用相應(yīng)的凝膠電泳緩沖液配置相應(yīng)濃度的凝膠。

2．微波爐加熱使凝膠融化，溫度降至60℃左右加入溴化乙錠（終濃度為0.5μg/ml）混勻。

3．將膠倒入槽中至厚度約3-5mm左右，梳子距槽底1-2mm，并去除氣泡。

4．倒入凝膠電泳緩沖液，小心拔去梳子。

5．DNA樣品與6×loading buffer混勻加入凝膠加樣孔中，接上電源，電壓降采用1－5V/cm，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)。

6．電泳一般30分鐘足矣，可根據(jù)溴酚蘭和二甲苯青FF的位置延長電泳時(shí)間，電泳完畢，UV下觀察。

三、注意

1．溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑兼有中毒毒性，使用時(shí)必須戴手套。

2．不同的DNA樣品需不同的電泳方案，需參見文獻(xiàn)。本文為一般常用法。

 


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