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上海酶聯(lián)生物研究所


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技術(shù)文章

RA33抗體檢測方法

閱讀：411發(fā)布時間：2011-11-29

免疫熒光法不是檢測該類自身抗體的合適方法，因常出現(xiàn)陰性結(jié)果，即使存在價的hnRNP A2／RA33抗體，也不能顯示出特征性核著染圖形。此外因該抗體不形成沉淀物，故而免疫擴(kuò)散方法也不適用。
以半純化的hnRNP A／B為抗原的蛋白質(zhì)印跡法是*的檢測方法。核提取物不純時也可應(yīng)用，但在鑒別蛋白條帶時可能會遇到困難，特別是SLE患者的血清?？捎酶嗡丨傊菍游龇ǐ@得hnRNP制劑，進(jìn)行12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印在硝酸纖維素膜上。血清用含3％的脫脂奶粉的20mm01／LTris-HCl或pH7．4磷酸鹽緩沖液做1：25稀釋，與膜上抗原一起孵育40min。在孵育液中應(yīng)避免含有去垢劑諸如TritonX-lOO或Tween20，因為據(jù)推測去垢劑將導(dǎo)致SLE血清的DNA-抗DNA免疫復(fù)合物的非特異性結(jié)合引起假陽性的結(jié)果。推薦在免疫檢測中應(yīng)用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，原因是某些過氧化物酶標(biāo)記的抗體可引起非特異性的染色，尤其是在hnRNP-A2帶。因為在SDS凝膠中蛋白移行成雙聯(lián)體，所以抗hnRNP-A1染色在大約33／34kD處可出現(xiàn)雙帶。抗hnRNP-A2／：RA33在大約36kD處染色成一帶，除此之外在37鄺8kD處相應(yīng)于hnRNP-B1／B2也有雙聯(lián)體。這些染色特征的出現(xiàn)被認(rèn)為可以更好的解釋蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。
采用高純度的天然hnRNP-A2的E1．ISA較蛋白質(zhì)：印跡法的靈敏度為高，特別是在檢測SLE和MCTD患者的血清方面。但是ELISA和蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果有時不一致，可能是因為暴露抗原決定簇的不同或者是識別了不同的抗原表位和（或）抗原的溶解度低有關(guān)。


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