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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：250發(fā)布時(shí)間：2012-8-3
小分子RNA，包括siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）、piRNA（piwi- interacting RNA）等，多次被美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)為“科技突破”和“科學(xué)進(jìn)展”，是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，這些小分子RNA幾乎存在于所有的真核生物細(xì)胞中，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育等方面起重要作用。
近年來(lái)研究表明，多種小分子RNA都存在3’末端甲基化，如植物中的miRNA、siRNA、hc-siRNA（heterochromatic small interfering RNA）、ta-siRNA（trans-acting siRNA）和nat-siRNA（natural antisense short interfering RNA），昆蟲(chóng)中的siRNA和piRNA，動(dòng)物中的piRNA。這些小分子RNA的3’末端甲基化可以使其免受細(xì)胞中多種核酸外切酶、連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、聚合酶等可作用于核酸3’末端羥基的酶攻擊，從而保護(hù)小分子RNA的穩(wěn)定。這些小分子RNA的3’末端甲基化盡管沒(méi)有改變核苷酸序列，卻給現(xiàn)有的高通量檢測(cè)技術(shù)（芯片技術(shù)、測(cè)序技術(shù)）帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。因現(xiàn)有的商業(yè)化高通量檢測(cè)方法大多基于酶標(biāo)記或酶連接，這些酶反應(yīng)都需要與小分子RNA的3’末端發(fā)生作用，而3’末端的甲基化會(huì)抑制酶反應(yīng)的效率，zui終導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確（芯片方法通常為信號(hào)假陰性，測(cè)序方法通常無(wú)法檢測(cè)到）。
中科院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所李炯課題組繼2011年在Nucleic Acids Research（鏈接）發(fā)表了實(shí)現(xiàn)常規(guī)小分子RNA（無(wú)修飾）的高通量非標(biāo)記芯片方法后，進(jìn)一步證實(shí)該方法也不受小分子RNA的3’末端甲基化影響，可以準(zhǔn)確檢測(cè)上述被修飾的小分子RNA（如圖c、d）;同時(shí)定量了商業(yè)化芯片中大量使用的Poly（A）聚合酶受3’末端甲基化的影響程度（甲基化小分子RNA的Poly（A）聚合酶反應(yīng)效率約為常規(guī)小分子RNA的1/24，如圖a、b）。
該工作近期發(fā)表于Analytical Chemistry雜志上，得到中科院、國(guó)家基金委及江蘇省自然科學(xué)基金委的大力支持。
此外，本非標(biāo)記芯片檢測(cè)方法還傳承發(fā)揚(yáng)了檢測(cè)無(wú)修飾小分子RNA的優(yōu)點(diǎn)：1.識(shí)別小分子RNA末端的單堿基缺失、冗余，以及末端1-3位單堿基的差異，這對(duì)常規(guī)芯片技術(shù)而言難以實(shí)現(xiàn);2.高靈敏度，檢測(cè)限為20 fM，檢測(cè)豐度跨4個(gè)數(shù)量級(jí)，滿足生物體內(nèi)絕大多數(shù)小分子RNA的檢測(cè);3.直接使用總RNA，無(wú)需預(yù)分離小分子RNA，無(wú)需樣品標(biāo)記，大幅度降低了檢測(cè)的時(shí)間和成本。
上述的非標(biāo)記芯片檢測(cè)方法不僅解決了現(xiàn)有商業(yè)化產(chǎn)品檢測(cè)小分子RNA中遇到的瓶頸問(wèn)題，為3’末端甲基化的小分子RNA高通量檢測(cè)提供了理想的解決方案，并且能夠推動(dòng)甲基化小分子RNA的功能研究，為“表觀遺傳學(xué)”和“后基因組”研究發(fā)展做出貢獻(xiàn)。
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