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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：298發(fā)布時(shí)間：2012-9-27
來自斯坦福大學(xué)的Michael Z Lin，與加州大學(xué)圣地亞哥分校的錢永健等人發(fā)表了題為“Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins”的文章，獲得熒光蛋白研究的重要突破——設(shè)計(jì)了兩個(gè)熒光蛋白，Clover 和mRuby2,，這兩種蛋白具有迄今為止zui明亮的熒光性和RFP特性。相關(guān)成果公布在Nature Methods雜志上。華裔科學(xué)家錢永健曾與另外兩位科學(xué)家，由于在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白GFP方面做出的貢獻(xiàn)而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Michael Z Lin在博士后期間曾在錢永健實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)工作，這兩師徒對(duì)于熒光蛋白都有著濃厚的興趣。
熒光蛋白之間的能量共振轉(zhuǎn)移FRET被廣泛用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞的生化過程，大部分以FRET為基礎(chǔ)的報(bào)告系統(tǒng)都采用的是CFPS和YFPs作為熒光基團(tuán)。然而，這兩者在FRET上都存在問題，不少CFP-YFP報(bào)告系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)FRET低動(dòng)力范圍，CFP的激發(fā)光合復(fù)雜光動(dòng)能事件，比如可逆光漂白和光電轉(zhuǎn)換，還會(huì)帶來光毒性。而且許多CFP和YFP為基礎(chǔ)的FRET報(bào)告系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的微小變化，因此當(dāng)生化反應(yīng)很微小，或或短暫的時(shí)候，就會(huì)造成檢測(cè)的困難。如果能開發(fā)出新型的熒光蛋白，就能克服CFPs和YFPs中出現(xiàn)的問題。
在這篇文章中，研究人員設(shè)計(jì)了兩個(gè)熒光蛋白，Clover 和mRuby2,，這兩者分別具有目前為止zui明亮的綠色和紅色，并且具有此前沒有達(dá)到的，zui高的Förster臨界半徑（Förster radius）——是指每一對(duì)FRET間50%能量轉(zhuǎn)移時(shí)的距離。研究人員從Aequorea victoria GFP和RFP mRuby20入手，構(gòu)建了zui明亮的熒光蛋白：Clover 和zui明亮RFP特性的mRuby2，這兩者有更大的動(dòng)態(tài)范圍，以及在現(xiàn)有四種FRET報(bào)告基因設(shè)計(jì)中的光穩(wěn)定性。利用改進(jìn)的報(bào)告系統(tǒng)——電壓傳感器，能更可靠的檢測(cè)單個(gè)動(dòng)作電位。此外，研究人員采用了改進(jìn)的RhoA報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證，研究顯示利用這些系統(tǒng)，在神經(jīng)神經(jīng)生長(zhǎng)錐 ephrinA刺激回縮過程中，RhoA的活性能迅速的被檢測(cè)到。
在激酶活性報(bào)告系統(tǒng)中利用Clover 和mRuby2替換CFP和YFP，小分子GTPase活性和跨膜電壓顯著提高了耐光性，F(xiàn)RET的動(dòng)態(tài)范圍和發(fā)射率變化，這些改進(jìn)能提高對(duì)短暫生化事件的靈敏性。除此之外，近期南加州大學(xué)一個(gè)研究小組利用從水母體內(nèi)分離出的生物熒光蛋白，“看到”了蛋白定向地通過神經(jīng)元以及大腦重建的過程。上世紀(jì)九十年代中期，科學(xué)家從水母體內(nèi)分離出綠色熒光蛋白（GFP）。GFP受到藍(lán)光照射時(shí)，會(huì)發(fā)出亮綠色的熒光。用GFP做標(biāo)記讓人們能看到細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)部的蛋白質(zhì)。但因?yàn)樯窠?jīng)元內(nèi)有許多不同的、互相重疊連接的路徑，至今還無法看到蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)部的流動(dòng)。研究人員開發(fā)出一種新技術(shù)，讓人們進(jìn)一步看清了蛋白質(zhì)是怎樣定向進(jìn)入到兩種區(qū)室之一的。他們通過阻塞單條路徑，使浸滿了GFP的運(yùn)輸泡產(chǎn)生堆積。運(yùn)輸泡是一種攜帶膜蛋白的小泡泡，能在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)上下移動(dòng)。然后用一種小分子藥物，使這些堆積的發(fā)光運(yùn)輸泡在一次強(qiáng)光脈沖下突然釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)那些攜帶膜蛋白質(zhì)的運(yùn)輸泡，應(yīng)該進(jìn)入樹突的并不是一開始就瞄準(zhǔn)了樹突區(qū)室，而是兩種區(qū)室都有進(jìn)入。但那些進(jìn)入軸突區(qū)室的很快就停下來，被阻止進(jìn)一步深入。
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