大鼠（Rat）腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒使用說明書
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預
先包被腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體的包被微孔中，依次加入標
本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB
顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化
成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）
呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣
品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞
刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于
-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結晶*溶解
后再使用。
2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3. 濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明
書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結果乘以5才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板 12孔×8條 12孔×4條 無
標準品 0.3mL*6管 0.3mL*6管 無
* 6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液 6mL 3mL 無
封板膜 2張 2張 無
說明書 1份 1份 無
自封袋 1個 1個 無
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、20、40、80、160、320pg/mL
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩
沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡
孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 樣本孔先加待測樣本10μL，再加*40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去
洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的
OD值。
結果判斷
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應
OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于
0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0pg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6個月
免責聲明
1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所
產(chǎn)生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。
2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者
承擔。
FOR FORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
RatTumornecrosisfactorα（TNF-α）ELISAKit
instruction
Intendeduse
ThisTNF-αELISAkitis intended LaboratoryforResearchuseonlyandis notfor
usein diagnosticortherapeutic procedures.TheStopSolutionchangesthe color
from blueto yellowandthe intensity ofthe coloris measuredat450nmusinga
spectrophotometer.In orderto measurethe concentrationofTNF-αin the sample,
this TNF-αELISAKitincludes a set of calibration standards. Thecalibration
standards areassayedatthe same time asthe samples andallowthe operatorto
produce a standard curve ofOpticalDensityversus TNF-αconcentration. The
concentrationofTNF-αinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.of
thesamplestothestandardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum- Useaserum separator tube andallowsamples to clotfor 30minutes
beforecentrifugationfor10minutesatapproximay3000×g.Removeserumand
assayimmediay oraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoid repeated
freeze-thawcycles
Plasma- CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifuge
samplesfor 30minutesat3000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Store
samplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulates
bycentrifugationandassayimmediay oraliquotandstore samples at-20℃or
-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note: Thesamplesshoulebecentrifugateddequayandnohemolysisor
granulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1. Standardmicroplatereader（450nm）
2. PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3. 37℃incubator
Precautions
1. Donotsubstitutereagents fromonekit toanother. Standard,conjugateand
microplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedby
manufacturer.
2. Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntil needed.Unusedstrips
shouldbestoredat2-8°Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3. Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature
（20-25°C）
Materialssupplied
Name 96determinations 48determinations
Microelisastripplate 12*8strips 12*4strips
Standard 0.3ml*6tubes 0.3ml*6tubes
SampleDiluent 6.0ml 3.0ml
HRP-Conjugatereagent 10.0ml 5.0ml
20XWashsolution 25ml 15ml
ChromogenSolutionA 6.0ml 3.0ml
ChromogenSolutionB 6.0ml 3.0ml
StopSolution 6.0ml 3.0ml
Closureplatemembrane 2 2
Usermanual 1 1
Sealedbags 1 1
Note:Standard（S0→S5） concentration wasfollowed by:0,20,40,80,160,320
pg/ml.
Reagentpreparation
20×washsolution:DilutewithDistilledordeionizedwater1:20.
Assayprocedure
1. Prepareall reagentsbeforestartingassayprocedure.It isrecommendedthat
all StandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStripplate.
2. Addstandard: SetStandardwells, testing samplewells.Addstandard50μl to
standardwell.
3. AddSample:Addtesting sample10μlthen addSampleDiluent40μlto testing
samplewell;Blankwelldoesn’taddanyting.
4. Add100μlofHRP-conjugatereagenttoeachwell,coverwithanadhesivestrip
andincubatefor60minutesat37°C.
5. Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessfourtimesforatotaloffive
washes.WashbyfillingeachwellwithWashSolution（400μl）usingasquirtbottle,
manifolddispenser or autowasher. Completeremoval of liquid at each step is
essentialto goodperformance.Afterthe last wash,remove anyremaining Wash
Solutionbyaspiratingordecanting.Invertthe plateandblotit againstcleanpaper
towels.
6. AddchromogensolutionA50μl andchromogensolutionB50μl to eachwell.
Gentlymixandincubatefor15minutesat37°C.Protectfromlight.
7. Add50μl StopSolutionto eachwell.Thecolorin the wellsshouldchange
frombluetoyellow.Ifthecolorinthewellsisgreenorthecolorchangedoesnot
appearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
8. ReadtheOpticalDensity（O.D.） at450nmusingamicrotiter platereader
within15minutes.
Calculationofresults
1. Thisstandardcurveis usedto determinethe amountin anunknownsample.
Thestandard curve is generated by plotting the average O.D.（450 nm）
obtainedfor eachofthe sixstandardconcentrationsonthe vertical（Y） axis
versusthecorrespondingconcentrationonthehorizontal（X）axis.
2. First,calculatethe meanO.D.valuefor eachstandardandsample.AllO.D.
values,aresubtracted bythe meanvalueofthe zerostandard beforeresult
interpretation. Constructthe standard curve usinggraphpaperorstatistical
software.
3. Todeterminethe amountin eachsample, first locate the O.D.valueonthe
Y-axisand extend a horizontalline to the standard curve. Atthe pointof
intersection, drawa verticalline to the X-axisand read the corresponding
concentration.
4. Anyvariationin operator,pipettingandwashingtechnique, incubationtime or
temperature, andkitagecancausevariationin result.Eachusershouldobtain
theirownstandardcurve.
5. Thesensitivitybythisassayis1.0pg/ml
6. Standardcurve
Storage：2-8℃.
validity：sixmonths.
FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICOR
DIAGNOSTICAPPLICATIONS!PLEASEREADTHROUGH
ENTIREPROCEDUREBEFOREBEGINNING!
