大鼠*（cAMP）ELISA試劑盒

原理

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 cAMP 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 cAMP與單抗結(jié)合，加入*化的抗大鼠cAMP，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與*結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，zui后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，cAMP濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中cAMP濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

酶標(biāo)板（Coated Wells）
96孔
酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate）
12ml

10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer）
12ml
20×濃縮洗滌液（Wash Buffer）
50ml

標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：1000pmol/瓶
2瓶
底物工作液（TMB Solution）
12ml

*抗體工作液（Biotinylated Antibody）
12ml
終止液（Stop Solution）
12ml
 

準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1. 收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。血清、血漿至少作1：2稀釋（取50ul，加標(biāo)本稀釋液50ul,稀釋2倍）。細(xì)胞上清至少10倍稀釋。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成1000pmol/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，*管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在*管中加1000pmol/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。

3. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測(cè)程序

1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。

3. 每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6. 洗板：同前。

7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8. 每孔加入100ul終止液混勻。

9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

結(jié)果計(jì)算與判斷

1. 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 pmol/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)cAMP含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能

1. 靈敏度：zui小的cAMP 檢測(cè)濃度小于1pmol/ml。

2. 特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的大鼠cAMP。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于8.9％。

注意事項(xiàng)

1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！