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DNA合成的亞磷酰胺三酯法

閱讀：3855發(fā)布時(shí)間：2011-10-17

亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，已被DNA合成儀廣泛使用，使得合成DNA片段成為一件非常簡(jiǎn)單易行的工作。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端，相鄰的核苷酸通過3，一5，磷酸二酯鍵連接。

合成的*步是將預(yù)先連接在固相載體上其活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5，—羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5，—羥基；

第二步，合成DNA的原料（亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合，得到反應(yīng)活性很高的核苷亞磷酸活化中間體（它的3’端被活化，5’—羥基仍然被DMT保護(hù)），與溶液中游離的5，—羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，這個(gè)反應(yīng)時(shí)間很快。

第三步是帶帽反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有的極少數(shù)5，—羥基沒有參加反應(yīng)（合格的合成試劑縮合效率一定會(huì)大于98％，所以未參加反應(yīng)的少于2％），合成過程使用乙酸酐和l—甲基咪唑使這些核苷5’—羥基反應(yīng)形成酰，終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉。這步反應(yīng)同樣是快速的；

第四步，縮合后在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。

經(jīng)過以上四個(gè)步驟，一個(gè)脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5’—羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。


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