模平行測序技術使得研究人員能夠對基因組進行快速的深度測序，從而從根本上改變了基因組學的發(fā)展。在本期的《自然-方法學》（Nature Methods）和《自然》（Nature）雜志兩篇的論文中Underwood和Kertesz兩個研究小組利用高通量測序技術確定了所有RNA轉錄物的二級結構。

    在過去的一些研究中全基因組測序技術被應用于確定細胞結構與DNA區(qū)域或mRNAs之間形成的復合物的特征。雖然這些研究提供了關于調控復合物組成的信息，然而研究人員卻無法解析這些RNAs的結構

    zui近的研究證實RNAs在調控基因表達和基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮了多重功能，這一課題日益引起了研究界的廣泛關注。在這些調控過程中，RNA的結構是一個關鍵的影響因素——決定了是直接監(jiān)控外部或內(nèi)部信號，或是為反式作用因子提供特異的結合位點。

    RNA轉錄物是一種單鏈分子，當其發(fā)生自身折疊并形成Watson-Crick堿基對，可生成各種長度和不同復雜性的發(fā)夾結構。發(fā)夾結構是RNA中zui普通的二級結構形式，其進一步組裝則形成了復雜的三維結構。了解RNA二級結構是研究人員揭示RNA活性，發(fā)現(xiàn)伴侶蛋白結合印跡及突變影響關鍵性的*步。

    對于結構穩(wěn)定的RNAs，檢測其二級結構zui和安全的方法就是對同源序列進行種系發(fā)生比較?？茖W家們認為同源序列可生成相似的折疊，從而維持了相同的核心螺旋數(shù)目和長度。在保守的Watson-Crick堿基對區(qū)域，Watson-Crick堿基對改變通常是兩個核苷酸遵循Watson-Crick堿基配對而同時發(fā)生變化。然而在種系發(fā)生過程中由于序列具有高度保守性此時該機制不發(fā)生作用，從而不顯示核苷酸協(xié)同變異。

    當RNA具有超過一個穩(wěn)定折疊的結構時，種系發(fā)生比較是非常困難的。在這種情況下，研究人員只能借助電腦模擬的方法，基于實驗獲得堿基對能量集合通過zui大化堿基對數(shù)目計算出zui小的二級結構自由能。

    在試驗中研究人員可通過化學檢測或酶檢測的方法解決這些問題。這些試驗可在缺乏或存在蛋白質或其他配體以及各種溫度或條件下在體外或體內(nèi)完成。無論是化學檢測還是酶檢測，RNA的可接近性都是反應的重要標準。在化學檢測中，一個成分確定的化合物可通過與RNA堿基上某個精密位點或糖磷骨架發(fā)生反應，從而對RNA起作用。

    在酶檢測中，則是用一種RNA切割酶與RNA的非配對或配對區(qū)域發(fā)生反應。通過這種檢測方法（通常在引物延伸后用凝膠電泳方法檢測片段）顯示出在結構上與化合物或酶易于接近的堿基。化合物檢測生成的是原子水平的信息，而酶檢測主要生成螺旋和非螺旋區(qū)域的信息。這些實驗方法通常工作量大，在各種操作過程中需要多種專業(yè)知識。這樣的數(shù)據(jù)可局限性地應用于計算機折疊程序中，利用序列預測RNA的二級結構。

    Underwood和Kertesz利用了高通量深度測序策略獲得了從細胞中抽提的RNA轉錄物復合物的二級結構信息（圖1）。在兩篇論文中，研究人員分別獲得了來自酵母或小鼠細胞的RNAs，在確定的實驗條件下按照選擇的尺寸對其進行酶水解。酶水解的RNA產(chǎn)生了5′-磷酸基，利用接頭選擇性連接切割的片段而非帶有5′-OH片段的水解降解產(chǎn)物。在反轉錄和PCR擴增后，對生成的文庫進行深度測序。

圖1：利用深度測序進行全基因組RNA結構檢測
圖1通過圖示概述了Kertesz（左）和Underwood（右）所用的方法。注意在Underwood的研究中，孵育對照（有或無激酶處理組）是平行完成的。

    這兩篇論文使用的方法不同之處在于所使用的酶以及數(shù)據(jù)處理的方式。Kertesz等利用了兩種酶：RNase V1，可特異識別RNA雙鏈區(qū)域；S1單鏈核酸酶（nuclease S1）,可特異性識別RNA單鏈區(qū)域。zui后的得分是RNase V1和nuclease S1從分析殘基后的核苷酸開始切割形成的片段讀數(shù)的log值。Underwood等利用了一個特異識別RNA單鏈區(qū)域的P1單鏈核酸酶（nuclease P1），并設立了兩個對照，其中一個未經(jīng)核酸酶處理以估計內(nèi)源切割保留的5′磷酸鹽的量，另一個則加入了T4連接酶檢測未保留5′磷酸鹽的切割。zui后得分是核酸酶組與對照組計數(shù)值的log值。

    酶檢測的一個重要條件是每個RNA分子僅能切割一次，因為二次切割將無法反映其天然狀態(tài)。所有類型的RNA分子切割條件很少相同，并且不能確定單擊動力學是否完成。Kertesz等，過假定堿處理導致了5′-OH片段，且這種5′-OH片段可避開深度測序分析而對非特異性切割進行間接控制。Underwood等在分析中就間接考慮了控制，因此數(shù)據(jù)在更堅實的基礎上（圖1）。

    Underwood等采用的方法具有的明顯優(yōu)勢，作者提供了一個軟件可將圖形序列讀值轉化為一種可被加州大學圣克魯斯分校（UCSC）基因組瀏覽程序識別的格式序列，也可通過輸入到一種RNA預測軟件中得到與實驗數(shù)據(jù)和能量zui小化計算結果相容的二級結構結果。

    將S1或P1單鏈核苷酸與RNase V1結合使用提供了互補的信息，并對RNA結構分析添加了限制。這些酶探針通常對空間位阻敏感，因此不會生成RNA結構的原子信息。在未來研究人員有可能利用化學探針提供更詳細的信息，并使其在體內(nèi)容易使用

    雖然這兩種方法都有著相同的缺點即由于需從細胞中抽提RNAs并在緩沖液中復性從而有可能生成體外結果，然而它們打開了多個研究方向。其衍生的一個生物體基因組上的RNA結構動力學完整圖像對應著廣泛的環(huán)境條件例如溫度、pH值或其他。利用平行測序，并通過在原核或真核細胞中添加各種調控因子（RNA結合蛋白、代謝產(chǎn)物或調控反式作用RNA）的方法可對全RNA的結構變化進行監(jiān)控。這一實驗還將有助于鑒別靶向調控因子的整套原始RNA?，F(xiàn)在在活細菌中或在真核細胞無生命或有生命壓力下對對應環(huán)境變化的RNA結構動力學進行*檢測已經(jīng)成為了可以達成的目標。而那樣的一種“RNA結構組”將是在活生物體內(nèi)建立以RNA為基礎的調控和反應性網(wǎng)絡所必需的。

來源：生物通