近日來(lái)自霍華德• 休斯醫(yī)學(xué)院Janelia Farm Research研究所的科學(xué)家們開發(fā)了一種新型顯微鏡技術(shù)，并利用這一技術(shù)中在單個(gè)活細(xì)胞中獲得了高分辨率的三維（3D）亞細(xì)胞影像。研究人員將這一新技術(shù)命名為“貝塞爾光束平面照明顯微鏡”（ Bessel beam plane illumination microscopy），這種顯微鏡將幫助研究人員比以往更深入地觀察活體中的生物進(jìn)程。相關(guān)研究成果發(fā)表在3月4日的《自然方法學(xué)》（Nature methods）雜志上。

    這一研究小組的負(fù)責(zé)人是霍華德• 休斯醫(yī)學(xué)研究所的Eric Betzig教授。他從事高分辨顯微鏡技術(shù)的開發(fā)及研究工作已超過(guò)30年。“盡管在這30年里取得了飛速的發(fā)展，然而由于大量的顯微鏡技術(shù)都需要對(duì)將樣本進(jìn)行切割和固定成像，因而獲得的只能是來(lái)自死細(xì)胞的靜態(tài)圖像，從而阻礙了顯微鏡技術(shù)應(yīng)用到更廣泛的研究領(lǐng)域，”Eric Betzig說(shuō)。

    早在2006年，Betzig就著手研究改良活細(xì)胞顯微鏡技術(shù)的新途徑。當(dāng)時(shí)他將設(shè)計(jì)新顯微鏡技術(shù)的焦點(diǎn)放在了突破空間分辨率的限制上。在不久后，Betzig以及同事Harald Hess就開發(fā)出了一種光敏定位顯微鏡（PALM），PALM可以用來(lái)在10-20納米范圍內(nèi)觀察生物圖像，相對(duì)于電子顯微鏡有更清晰的對(duì)比度。

    然而PALM與大多數(shù)其他顯微鏡一樣，其工作原理是通過(guò)物鏡投射光層使樣本曝光，然后再將光線重新積聚返回至同一物鏡中。這種方法中采用的光線有可能對(duì)樣品造成損傷，并導(dǎo)致生成的影像模糊，因而無(wú)法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀察。

    2008年，Betzig便致力于攻克這些技術(shù)難題。他想到的一種方法就是利用平面照明顯微鏡技術(shù)。這一技術(shù)產(chǎn)生于100多年前，平面照明是指照射光線通過(guò)樣品的側(cè)面而非頂部。要達(dá)到這一效應(yīng)，必須采用兩個(gè)相互垂直的物鏡。“平面照明可使光線接近于樣品的焦點(diǎn)區(qū)域，”Betzig說(shuō)。

    盡管其他的研究人員包括Janelia Farm Research研究所的工作人員Philipp Keller利用平面照明在數(shù)百納米的范圍內(nèi)獲得了多細(xì)胞生物體的影像。然而由于光層仍然太厚使得研究人員無(wú)法有效地在數(shù)十納米的范圍內(nèi)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行成像。利用平面照明獲得的大片的光線仍然存在影像模糊和光損傷等問(wèn)題。為了攻克這一難題，Betzig研究小組利用了貝塞爾光束（Bessel beam）。貝塞爾光束是物理學(xué)家們?cè)?0世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一種特異的無(wú)衍射光束，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用在超市的條形碼掃描儀中。研究人員證實(shí)利用這種光束掃描樣品可產(chǎn)生更薄的光層。

    此外，Betzig還采用了另一種稱為雙光子顯微鏡的策略，這種方法常用于神經(jīng)科學(xué)研究中對(duì)腦組織進(jìn)行分層成像。雙光子顯微鏡技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)之一在于可使微弱曝光的區(qū)域生成極少的熒光信號(hào)。因此當(dāng)使用雙光子技術(shù)時(shí)，可在保留貝塞爾光束狹長(zhǎng)中心光線的同時(shí)減少兩側(cè)的背景影像。

    基于這些策略研究人員成功地構(gòu)建了貝塞爾光束平面照明顯微鏡。由于貝塞爾光束平面照明顯微鏡投射超薄的光層通過(guò)樣本，移動(dòng)通過(guò)超薄光層的樣本形成每一層的圖像。貝塞爾光束平面照明顯微鏡不會(huì)模糊光線，因此使樣品的影像更為清晰銳利，而沒(méi)有通常的背景影像。觀察結(jié)束后，完成的樣品還可以繼續(xù)存活生長(zhǎng)。貝塞爾光束平面照明顯微鏡還因使用超薄層光（thin slices of light）“掃描”樣品，而非全部聚焦整個(gè)樣品，因而將光線造成的損傷zui小化并有助于延續(xù)樣品的生命。整個(gè)觀測(cè)過(guò)程非常迅速，在一秒鐘的時(shí)間內(nèi)研究人員就可獲得200個(gè)詳細(xì)的影像，并在1-10秒鐘內(nèi)生成由數(shù)百?gòu)埗S影像組合形成的分辨率為0.3 μm的的三維圖像。

    在Janelia Farm的研究人員看來(lái)，貝塞爾光束平面照明顯微鏡的誕生對(duì)于基礎(chǔ)研究和顯微技術(shù)而言都是一個(gè)重要突破。因?yàn)樗粌H比現(xiàn)有的顯微技術(shù)更加強(qiáng)有力，而且為生物學(xué)家研究完整生物系統(tǒng)提供了銳利武器。Betzig強(qiáng)調(diào)說(shuō)，貝塞爾光束平面照明顯微鏡對(duì)于發(fā)育生物學(xué)研究和觀察細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)特別有價(jià)值，科學(xué)家藉此可以獲得以往不可能得到的圖像，因此它必將拓展人類科學(xué)研究的能力。

來(lái)源：生物通