分子剪刀改造微藻基因組 助推第三代生物燃料研發(fā)

近日，法國大型生物技術(shù)公司Cellectis總裁安德烈·舒利卡（Andre Choulika）表示，從現(xiàn)在起到2013年1月公司將證明基因組改造能使用微藻來制造第三代生物燃料。目前Cellectis公司應(yīng)主要證明其技術(shù)在藻類植物中的有效性。

Cellectis公司研發(fā)了能夠干預(yù)脫氧核糖核酸（ADN）的分子剪刀，通過此分子剪刀，公司能夠改變或更換疾病突變載體基因，并改變植物機體。該公司還負責實現(xiàn)分子剪刀的商業(yè)化。公司已經(jīng)將該技術(shù)推廣到生物生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)的學術(shù)研究中。

基因組改造實驗如果成功，從2013年1月起的未來四年內(nèi)公司將在法國石油化工集團道達爾公司（Total）的協(xié)助下進行石油代用品的試驗生產(chǎn)。該階段的投資金額將達到數(shù)百萬歐元。

根據(jù)雙方簽訂的協(xié)議，Cellectis公司和道達爾公司將共同支付該項目所需的成本。目前，兩家公司均沒有透漏相關(guān)的財務(wù)信息。從2012年2月起十名研究人員就已經(jīng)開始共同從事該項目的研究，此外，兩家公司將分別持有相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品50%的份額。舒利卡表示，在zui初幾年內(nèi)，該項目每年的開發(fā)成本將至少為數(shù)百萬歐元。而在試點階段，所需金額將達到數(shù)千萬歐元。

基因組改造技術(shù)

普魯蘭酶基因克隆表達及枯草芽孢桿菌基因組的改造[1]

根據(jù)整合到基因組上的目的基因來源，分別構(gòu)建了兩種整合方式的載體，即單交換和雙交換整合載體。對于枯草芽孢桿菌本身來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因bdbC，bdbD，直接將其作為同源片斷，由于bdbC，bdbD共用一個啟動子，在基因組上以操縱子的形式存在，因此構(gòu)建的單交換載體命名為pACC-BdbDC。對于大腸桿菌來源的巰基-二硫鍵氧化還原酶基因ds.C，dsbD，dsbE，dsbG，則需要在枯草芽孢桿菌基因組上選擇整合位點，在其整合位點附近各選取500bp基因作為同源片斷，克隆到pBSK-p1p4-Cm上，構(gòu)建了基因敲除載體。再將dsbC，dsbD，dsbE，dsbG插入到該載體的兩個同源片斷之間，分別構(gòu)建了雙交換載體pDGC和pDsbE。將以上構(gòu)建好的單交換和雙交換載體分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.su.168，結(jié)果巰基-二硫鍵氧化還原酶基因整合到枯草芽孢桿菌基因組上，成功改造了枯草芽孢桿菌遺傳背景。

戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長cDNA的構(gòu)建及其改造[2]

傳統(tǒng)的以限制性內(nèi)切酶和連接酶為基礎(chǔ)的DNA重組技術(shù)曾經(jīng)革命性地推動了分子生物學和遺傳工程的發(fā)展，至今仍然發(fā)揮著重要作用。但是實驗室原有的片段太多，找酶切位點比較困難。用overlap pcr連成4個長片段后就相對容易一些，利用4626位置上的KpnⅠ和載體上的XbaⅠ這兩個酶切位點將中間兩段連接，從而形成3個大片段（1～2474，2094～6645，5186～7232）。In-fusion法的原理跟基因同源重組類似，利用DNA片段的同源關(guān)系將目的片段定向地插入載體中。這個方法只需一個單一的酶切位點將載體線性化即可，不需要兩個單一的酶切位點，條件沒有前面苛刻，所以結(jié)合這個方法用于zui后兩步連接。先利用載體上的XbaⅠ酶切位點將前兩段連接（1～5318），然后利用5245位置上的FseⅠ酶切位點將zui后兩段連成HEV的全長cDNA。In-fusion法需要重新設(shè)計引物，使目的基因的兩端帶有載體兩端的同源序列。雖然也涉及到PCR過程，但是以質(zhì)粒為模板，難度相對overlap PCR要小，可以擴增3kb左右大小的片段用于連接。

為了保證這個HEV的全長cDNA克隆具有感染性，又對它進行了修正。在測序之后發(fā)現(xiàn)5’端有94個堿基與原序列比對不上，另外在2467的位置多出了5個堿基，我們需要將這一段替換掉。為了保證序列的準確性，重新從病料中提取SAAS-JDY5株的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）。設(shè)計套式特異性引物，并在5’端引入T7 RNA聚合酶啟動子，進行巢式PCR（Nest-PCR）擴增出目的片段，用新的正確的片段替換掉原來錯誤的片段，獲得正確的SAAS-JDY5株HEV的全長cDNA克隆。

基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇工業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵性能[3]

通過化學誘變和基于基因組DNA誘變的遺傳重組技術(shù)對乙醇工業(yè)酵母菌的溫度適應(yīng)性進行改造，獲得耐熱性能和發(fā)酵性能得到提高的重組釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae T44-2。重組菌株T44-2的zui高生長溫度比原始菌株CE6提高了3℃，48℃和52℃熱激處理1 h，重組菌株的細胞存活率分別是原始菌株的1.84和1.87倍。重組菌株在30℃～40℃范圍內(nèi)具有良好的糖醇轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)量，發(fā)酵200g/L葡萄 糖能夠產(chǎn)生83.8～91.2 g/L乙醇。重組菌株在43℃和44℃發(fā)酵時乙醇產(chǎn)量仍分別有69.2 g/L和52.6g/L，而此時原始菌株基本沒有活性。研究結(jié)果為釀酒酵母在乙醇高溫發(fā)酵中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，可極大降低冷卻成本。

生物燃料研究

生物燃料發(fā)展態(tài)勢分析[4]

*代生物燃料的生產(chǎn)工藝已經(jīng)較為成熟，美國、歐盟和巴西等一些國家已經(jīng)形成了較完善的產(chǎn)業(yè)鏈。以纖維素乙醇為代表的第二代生物燃料是更有希望的替代燃料，但目前還未獲得關(guān)鍵性的技術(shù)突破，其大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)尚待時日。目前生物燃料正處于從*代向第二代發(fā)展過渡的初期。各國紛紛將發(fā)展第二代生物燃料定為國策，為此制訂了長期的發(fā)展規(guī)劃與目標，并為生物燃料發(fā)展提供了良好的政策環(huán)境和大力的經(jīng)費支持。各相關(guān)研究機構(gòu)與企業(yè)也積極行動，力圖解決生物燃料發(fā)展的各個關(guān)鍵問題。在此過程中，一些與生物燃料可持續(xù)發(fā)展有關(guān)的重要問題也引起了人們的關(guān)注。

利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進展[5]

生物柴油和生物質(zhì)油的可持續(xù)健康穩(wěn)定發(fā)展，必須有穩(wěn)定和的原料來源。藻類生物質(zhì)即是生產(chǎn)生物燃料的優(yōu)良原料。本論文介紹了微藻的概念，綜述了利用微藻制備生物柴油和生物質(zhì)油的國內(nèi)外研究進展，尤其是制備微藻方面的生物基因工程、新反應(yīng)器和聯(lián)產(chǎn)技術(shù)，以及微藻直接熱解制備生物質(zhì)油和直接燃燒利用的技術(shù)。探討了利用微藻制備生物燃料的優(yōu)點和存在的問題。

Cellectis公司的舉動

法國Cellectis公司獲得日本Tobacco公司Pureintro技術(shù)*

法國基因技術(shù)公司Cellectis公司的美國分公司Cellectis Plant Sciences（位于明尼蘇達州圣保羅）獲得了日本Tobacco公司*，獲準使用Tobacco公司的土壤桿菌介質(zhì)轉(zhuǎn)化植入技術(shù) PureIntro，celletics公司將可以使用這個技術(shù)來研發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米和水稻產(chǎn)品。

Cellctis 公司在大范圍核酸酶基因工程研究領(lǐng)域處于地位，它的許多研究成果被成功運用于多種作物上，能對基因序列進行插入，刪除或者改性操作，使得植物能表達出 新的性狀（比如抗旱，提高營養(yǎng)成分，抗病害等），美國分公司Cellectis plant sciences是于今年剛剛成立的，負責基因工程涉農(nóng)領(lǐng)域的全面研究。

Cellectis推出源于人誘導多能干細胞（iPS）的肝細胞產(chǎn)品

法國生物公司Cellectis集團下的Cellectis干細胞部宣布推出來源于人誘導多能干細胞（iPS）的肝細胞產(chǎn)品，即hiPS-HEP。hiPS-HEP具同質(zhì)性、再生性及生命周期長且CYP活性穩(wěn)定的特點，能夠為藥物發(fā)現(xiàn)、毒性試驗與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺。

Cellectis干細胞部科學家（CSO）Johan Hyllner表示，各醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)間的的高度相關(guān)性會使hiPS-HEP成為頗具前景的研發(fā)系統(tǒng)。“制藥企業(yè)迫切需要應(yīng)用于藥物研制早期更佳的、與臨床相關(guān)性更高的模型，以評價肝毒性、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點及研發(fā)新疫苗，”Hyllner 補充道。hiPS-HEP來源于人誘導多能干細胞（iPS），嚴格依照質(zhì)量控制和倫理批準程序。

[1] 胡海紅.普魯蘭酶基因克隆表達及枯草芽孢桿菌基因組的改造. 生物化學與分子生物學. 2009

[2] 王茜.戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株基因組全長cDNA的構(gòu)建及其改造. 南京農(nóng)業(yè)大學. 2010

[3] 劉秀穎，何秀萍，盧瑩，張博潤.基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇工業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵性能. 生物工程學報. 2011

[4] 鄧勇,房俊民,陳方,*偉,王春明.生物燃料發(fā)展態(tài)勢分析[J]. 中國生物工程雜志. 2008

[5] 嵇磊, 張利雄, 姚志龍, 閔恩澤.利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進展[J].石油學報.2007

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