ELISA試劑盒在體外進(jìn)行培養(yǎng).使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。

細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響;二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技術(shù)，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機(jī)體后的—些變化。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

這次的動物細(xì)胞培養(yǎng)是一個精細(xì)的，需要有步驟、有計劃的進(jìn)行的實驗。主要步驟有：1、清洗與滅菌;2、培養(yǎng)基配制;3、Hanks、D-hanks液和消化液的配制、4、細(xì)胞傳代培養(yǎng);5、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇?？煞謳状涡嶒炦M(jìn)行操作。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實驗?zāi)康?/p>

能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。

二、實驗原理

清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的*步，是組織培養(yǎng)中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不*有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0.1個，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，ELISA試劑盒即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實驗材料、用品

1、材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22 μm，過濾器(直徑25)。

2、藥品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，*，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0.1%的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

3、儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實驗步驟

(一)實驗器具清洗

l 玻璃類 1、主要有：培養(yǎng)瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心管，試管，培養(yǎng)皿等。

2、清洗步驟：

泡在含有洗潔凈的自來水中→撈出來用毛刷將實驗器具各個面刷洗至少25遍→自來水沖洗25遍→過一遍一蒸水→泡入鉻酸,過夜(24h左右)→從鉻酸中撈出器具，自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子備用→用前高溫滅菌(121℃，25min)→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡鹽酸1天，然后清洗步驟與上面相同。

l 塑料類

1 塑料類器具主要包括：孔板，大槍頭，瓶蓋，濾器，*等。

2 清洗步驟：

(1)孔板，*

泡在有洗潔凈的自來水中→用超聲清洗儀超聲3遍(每遍1小時，200C)→在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→過一遍一蒸水→泡入鹽酸過一個禮拜→從鹽酸中撈出后自來水沖洗25遍→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好照鈷→使用

(2)大槍頭，蓋子，濾器

在含有洗潔凈的自來水中用毛刷或者紗布將各個面刷洗至少25遍→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→自來水沖洗→過三遍一蒸水(每遍3次)，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好滅菌→使用

注意：(1)烘孔板時溫度不應(yīng)太高，烘干后用報紙包裹，裝入箱子內(nèi)，照鈷，便可使用。

(2) 新的培養(yǎng)瓶蓋子泡舊5%*1天→再用2%NaOH煮20min →自來水沖洗→洗潔精清洗→用超聲清洗儀超聲1遍(每遍45分鐘，200C)→沖洗15遍→過三遍一蒸(每遍3次)→過三遍三蒸水→烘干使用

(二)包裝與消毒

2、包裝

洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙(油光紙)等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。比如小青瓶，試管，移液管，血清瓶，培養(yǎng)瓶，離心管，孔板，槍頭，針式濾器等的包裝。其中針式濾器包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中 。

2.1 包裝分類

局部包裝：較大瓶皿如細(xì)胞培養(yǎng)瓶，燒杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如*瓶等的包裝，通常采用局部包裝。

全包裝：體積較小的培養(yǎng)瓶皿，注射器，ELISA試劑盒膠塞及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現(xiàn)多采用直接裝入鋁飯盒的方法。用鋁飯盒來封裝小培養(yǎng)瓶，膠塞和膠帽等很好，但往往因蓋不嚴(yán)緊使用期限不宜太長。因鋁飯盒不透明，在蓋子宜寫上用品名稱以便于確認(rèn)，吸管在裝入消毒筒之前，先用少許脫脂棉將吸管接口端堵塞，松緊度適宜，過松易脫落，過緊不透氣，妨礙使用;然后裝入消毒筒中，消毒筒底部應(yīng)墊以軟紙或棉花以防吸管裝入時折斷管尖;zui后再包裝入筒中封口。