一般來說，在將目的基因?qū)怂拗骶w內(nèi)前，需要把目的基因與載體連接在一起構(gòu)建重組載體。要進(jìn)行有效的連接，必須先利用生物酶將目的基因和載體切割成合適的DNA片段。識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特殊核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶，簡稱限制酶。從原核生物中已發(fā)現(xiàn)了約400種限制酶，根據(jù)它們對DNA部位識別和切割的特異性，可分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型和Ⅲ型限制性內(nèi)切酶切割DNA時都需要消耗ATP，并且具有甲基化酶活性，其中I型酶在其識別位點約1000bp以外處隨機(jī)切割DNA；Ⅲ型酶在其識別位點附近進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。它們在重組DNA技術(shù)中沒有太大用處。只有Ⅱ型限制性內(nèi)切酶被廣泛應(yīng)用于DNA分子的體外重組。ELISA試劑盒

    與I型和Ⅲ型限制性內(nèi)切酶相比，Ⅱ型限制性內(nèi)切酶有如下特點：①識別特定的核苷酸序列，長度一般為4、5或6個核苷酸，通常具回文結(jié)構(gòu)(palindromic structure)；⑦具有特定的酶切位點，即限制性內(nèi)切酶在其識別序列的特定位點對雙鏈DNA進(jìn)行切割，切割后形成黏末端(或平末端)；③沒有甲基化修飾酶功能，一般只需要MgH 2+ 。不需要ATP和S一腺苷一L一蛋氨酸作為輔助因子。

    Ⅱ型限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA分子上能識別的特定核苷酸序列稱為識別序列或識別位點。它們對堿基序列有嚴(yán)格的專一性，被識別的堿基序列通常具有雙軸對稱性，即回文序列(Dalindromic sequence)。例如，從大腸桿菌中分離鑒定的EcoR I是zui早發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。EcoR I夠特異地結(jié)合在一段含這6個核苷酸的DNA區(qū)域里，在每一條鏈的*和腺嘌呤間切斷DNA鏈。DNA鏈經(jīng)EcoRI對稱切割后會產(chǎn)生兩個突出的5'-磷酸單鏈末端，每個末端有4個核苷酸延伸出來，相對應(yīng)的兩個單鏈末端的堿基序列互補，因而稱為黏性末端。

    有些Ⅱ型限制酶，如表6．2中的Pst I，它識別序列5'-CTGCAG一3'，并在A與G之間切割DNA雙鏈產(chǎn)生3'一突出黏性末端。還有些限制酶，如Bal I，切割DNA鏈后產(chǎn)生平齊的末端片段，成為平末端(blunt end)。ELISA試劑盒

    另外，也有一些不同來源的限制酶雖然識別不同的DNA序列，但切割產(chǎn)生的卻是相同的末端，這些酶稱為同尾酶(isocaudamer)。例如，限制酶BarnH I、Bcl I、BglⅡ和Xho Ⅱ都能識別各自的6核苷酸序列，且切點都在同一位置，依次為GGATCC、TGATCA、AGATCT和PuGATCPy．因此產(chǎn)生的DNA片段都具有一個相同的單鏈5'末端(GATC)。顯然，由同尾酶產(chǎn)生的DNA片段可以通過其黏性末端的互補作用彼此連接起來，因此同尾酶在基因克隆中非常有用。由兩種同尾酶分別產(chǎn)生的黏性末端共價結(jié)合而成的位點稱為“雜種位點"，在多數(shù)情況下，這樣的“雜種位點"將不再被原來的兩種同尾酶識別，但也有例外，如Sau 3A I產(chǎn)生的黏性末端與其同尾酶BamH I、Bcl I、Bst I、Bgt Ⅱ、XhoⅡ中的任何一個產(chǎn)生的黏性末端結(jié)合而成的“雜種位點"，均可被Sau3A I識別和切割。

    目的基因被限制性內(nèi)切酶切割后，所獲取的DNA片段與載體的連接是通過DNA連接酶(DNA ligase)催化雙鏈DNA缺口處相鄰的兩個脫氧核苷酸殘基上的5'-磷酸基和3'-羥基連接形成共價的磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶有兩種：一種是由大腸桿菌染色體上相關(guān)基因編碼的，叫做DNA連接酶；另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA上基因編碼的，叫做T4DNA連接酶(也常寫做T4DNA連接酶)。這兩種DNA連接酶除了前者以NAD+為輔助因子，后者以ATP為輔助因子外，其作用機(jī)理差別不大。由于T4DNA連接酶制備比較容易，還可以連接平末端，因此在DNA重組實驗中廣泛使用。DNA片段的體外連接方法主要有以下幾種。

(1)帶有互補黏性末端片段間的連接用相同的酶或用同尾酶處理可得到帶相同黏性末端的片段。為了與這類外源DNA片段連接，質(zhì)粒載體也必須用同一種酶處理，得到兩個相同的黏性末端。因此，就造成連接反應(yīng)時外源DNA片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串聯(lián)成寡聚物，而且也不容易控制連接方向。要解決這一問題，一方面可以調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA濃度。以便使正確的連接產(chǎn)物數(shù)量達(dá)到zui高水平；另外，也可將載體DNA的5'端磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酶去掉，zui大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。這樣帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的DNA重組子，這樣的重組DNA分子仍然可以轉(zhuǎn)入受體菌，并在宿主細(xì)胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)。

(2)帶有平末端片段間的連接這種片段是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶處理產(chǎn)生的，或者是由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比較低，因此所需要的T4DNA連接酶和外源DNA及載體的濃度均較高。有時還需加入低濃度的聚乙醇(PEG8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚，從而提高連接效率。但是，即便如此，平末端直接連接的效率仍不高。

(3)DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接待連接的兩個DNA片段經(jīng)過不同的限制性內(nèi)切酶切割后，產(chǎn)生的末端未必都是互補的黏性末端，或者未必都是平末端，無法進(jìn)行連接。這種情況下，連接之前必須對兩個末端或一個末端進(jìn)行修飾。修飾的方式主要是將黏性末端修飾成平末端，或?qū)⑵侥┒诵揎棾苫パa黏性末端。有時為了避免兩個DNA片段自行連接成環(huán)形DNA或多聚體，也可將載體DNA的5'端磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酶去掉，修飾成較為穩(wěn)定的一OH。

(4)人工接頭分子連接 在兩個平整末端DNA片段的一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接頭片段，這里面包含有某一限制酶的識別位點。經(jīng)這一限制酶處理便可以得到具有黏性末端的兩個DNA片段，進(jìn)一步便可以用DNA連接酶把這樣兩個DNA分子連接起來。ELISA試劑盒