人甲狀腺過氧化物酶（TPO）ELISA試劑盒說明書

檢測范圍:1.1 U/ml - 70 U/ml

zui低檢測限:0.4 U/ml

預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TPO含量。

說明：

1.人甲狀腺過氧化物酶（TPO）ELISA試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

3.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。 

實驗原理:用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TPO抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、化的抗TPO抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TPO呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 

人甲狀腺過氧化物酶（TPO）ELISA試劑盒 組成及試劑配制：

1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。 

2.標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶（凍干品）。

3.樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

4.標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 

9.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

10.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材：

1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,

2.高速離心機,

3.電熱恒溫培養(yǎng)箱,

4.干凈的試管和Eppendof管,

5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器,

6.蒸餾水，容量瓶等.

標(biāo)本的采集及保存： 

1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為70 U/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋70 U/ml，35 U/ml，17.5 U/ml，8.75 U/ml，4.375 U/ml，2.2 U/ml，1.1 U/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 U/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制35 U/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）70 U/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

標(biāo)記抗體的稀釋原則：臨用前以標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl標(biāo)記抗體加990μl標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

操作步驟：實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl標(biāo)記抗體加99μl標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。 

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 

3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

5.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法:

自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

注意事項：

1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

5.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人TPO，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月