人外周血淋巴細(xì)胞分離液說明書

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本產(chǎn)品是一種用于分離人外周血淋巴細(xì)胞的無菌、低內(nèi)毒素水平的密度梯度分離液。其分離原理是根據(jù)血細(xì)胞的密度差異（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度為1.090 g/mL左右；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/mL；血小板為 1.030~1.035 g/mL），通過離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將淋巴細(xì)胞從人外周血或臍帶血中分離出來。

產(chǎn)品指標(biāo)：

密度 1.077±0.001g/mL

滲透壓 290~350 mOsm/kg H2O

無菌 0.1μm  濾膜過濾

保存條件：

本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。

操作步驟：

1.取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

2.在離心管中加入適量分離液（當(dāng)稀釋后血液體積小于3mL時(shí)，加入3mL分離液；大于等于3mL，加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則會(huì)影響分離效果），將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時(shí)間較長(zhǎng)，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正常現(xiàn)象。）

3.室溫，水平轉(zhuǎn)子500~1000g，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，更好的分離條件需摸索，離心轉(zhuǎn)速zui大不超過1200g）。 

4.離心后將出現(xiàn)明顯的分層：zui上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層，離心管底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5.小心的吸取白膜層細(xì)胞到15mL潔凈的離心管中， 10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250g，離心10min。

6.棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心10min。

7.重復(fù)步驟6

8.棄上清，細(xì)胞重懸備用。

分離純度：

使用人淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞的分離純度大于90%。

注意事項(xiàng)：

• 開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間，請(qǐng)?jiān)跓o菌條件下啟封，避免微生物污染。。
• 分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會(huì)導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。
• 血液樣本為新鮮抗凝血（采血2 h以內(nèi)），為保持淋巴細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。
• 稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞得率及純度。
• 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。
• 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(huì)影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索更好的分離條件。
• 吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加；吸取過多的血漿層可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中血漿蛋白及血小板污染。
• 如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物污染。
• 不同動(dòng)物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。