實(shí)驗(yàn)原理

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長處。核酸的摩爾消光系數(shù)（或稱吸收系數(shù)）用來表示。為每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。測得未知濃度核酸溶液的A260nm值，即可以計(jì)算出其中RNA或DNA的含量。該法操作簡便，迅速，并對(duì)被測樣品無損，用量也少。

核酸摩爾消光系數(shù)及相應(yīng)光吸收值

蛋白質(zhì)也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm波長處，在260nm出的吸收值僅為核酸的1/10或更低，因此對(duì)于含有微量蛋白質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nmx吸收的比值則在1.9左右，當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，比值下降。若樣品內(nèi)混在有大量的蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光的物質(zhì)，應(yīng)設(shè)法先除去。

試劑和器材

一、試劑

鉬酸銨－過氯酸沉淀劑：取3.6mL 70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4mL蒸餾水中，即成0.25%鉬酸銨－2.5%過氯酸溶液。

5-6%氨水：用25-30%氨水稀釋5倍。

二、測試樣品

RNA或DNA干粉。

三、器材

移液管0.5mL（×2），2mL（×3）；容量瓶50mL（×3）；離心機(jī)；冰??；分光光度計(jì)。

操作方法

1．準(zhǔn)確稱取待測核酸樣品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH調(diào)成糊狀，再加適量水，用5-6%氨水調(diào)至pH7.0，定容至50mL。

2．取兩支離心管，甲管加入2mL樣品溶液和2mL蒸餾水，乙管加入2mL樣品溶液和2mL沉淀劑?；靹颍诒∩戏胖?0min。

3．在3000r/min下離心10min。從甲、乙兩管中分別吸取0.5mL上清液，用蒸餾水定容至50mL。選擇厚度為1cm的石英比色杯，在260nm波長處測定A值。

二、計(jì)算：

式中，為甲管稀釋液在260nm波長處A值減去乙管稀釋液在260nm波長處A值；

L──比色杯的厚度，1cm；N為稀釋倍數(shù)；

0.024──每毫升溶液內(nèi)含1μgRNA的A值；

0.020──每毫升溶液內(nèi)含1μgDNA鈉鹽的A值。

核酸％＝

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