Stable Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

Stbl3；Stbl2；HB101；Stable；Direct repeats 直接重復(fù)片段；Lentiviral expression vectors 慢病毒表達(dá)載體；Gibson Assembly 一步法克隆檢測(cè)試劑盒；

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產(chǎn)品組分：

菌株描述

Stable菌株是NEB公司開發(fā)的高轉(zhuǎn)化效率的大腸桿菌菌株，特別適合分離含重復(fù)元件和不穩(wěn)定插入序列的質(zhì)粒克隆，也適合分離和擴(kuò)繁逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體克隆。與商業(yè)化的同源重組反應(yīng)體系比如NEBuilder HiFi DNA Assembly，Gibson Assembly反應(yīng)體系和酶切連接體系都兼容。Stable菌株基因型與Stbl2，Stbl3沒有關(guān)聯(lián)性，但具有更優(yōu)異的性能（見圖1）?；蚪M含有重組酶recA1 relA1突變，能有效抑制長(zhǎng)末端重復(fù)序列的重組，降低了錯(cuò)誤重組的頻率。還含有核酸酶內(nèi)切酶endA1突變，避免了質(zhì)粒提取過程中核酸酶的污染，顯著提高制備質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量?；蚪M含有lacZΔM15，適用于藍(lán)白斑篩選。菌株本身含鏈霉素和四環(huán)素抗性，在成功轉(zhuǎn)化后賦予其額外的篩選標(biāo)志。

Stable菌株基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

菌株亮點(diǎn)

◇   Stable菌株具有很高的轉(zhuǎn)化效率，經(jīng)pUC19檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA；

◇   Stable菌株是基因克隆進(jìn)入腺病毒/慢病毒載體的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株是克隆正向重復(fù)序列和反向重復(fù)序列的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株含recA1突變，能減少克隆DNA的重組發(fā)生，從而降低錯(cuò)誤重組頻率；

◇   Stable菌株含mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，能有效轉(zhuǎn)化真核來源的甲基化DNA或PCR、cDNA和許多其他來源的非甲基化DNA;

◇   Stable菌株含endA1（非特異核酸內(nèi)切酶I）突變，確保得到zui高質(zhì)量和產(chǎn)量的質(zhì)粒；

◇   Stable菌株含fhuA突變，具有對(duì)噬菌體T1的抗性；

◇   Stable菌株含lacZΔM15，適用于具α-互補(bǔ)載體的藍(lán)白斑篩選；

產(chǎn)品描述

本品是Stable菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

Stable與Stbl3克隆性能（錯(cuò)誤重組率）的比較

圖1. Stable與Stbl3克隆不穩(wěn)定DNA序列的性能比較。pUC-5xREP含5 x 32bp 重復(fù)序列，其在普通大腸桿菌中很不穩(wěn)定。酶切后線性化的pUC19片段2.2ng+1ng 5xREP DNA段配制成重組反應(yīng)體系，重組反應(yīng)完成后分別轉(zhuǎn)化Stable感受態(tài)細(xì)胞（A）或Stbl3感受態(tài)細(xì)胞（B），復(fù)蘇60min，涂布在含50μg/ml羧芐青霉素的LB平板，30℃培養(yǎng)20h。之后做菌落PCR，檢測(cè)5xREP DNA插入的穩(wěn)定性（含有正確插入片段的克隆，菌落PCR片段為623bp）。

注意事項(xiàng)

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】【詳見MKBIO內(nèi)容】

附表1 固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2 固體和液體SOC培養(yǎng)基配方

附錄1. Stable感受態(tài)細(xì)胞常見問題【詳見MKBio內(nèi)容】

1.      Stable菌株的基因型和各基因賦予菌株的特征？

Stable基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

◇   藍(lán)白斑篩選（Φ80 Δ(lacZ)M15）：使得β-gal omega段。lacX74去除染色體上的β-gal基因。pUC19和相似基因編碼β-半乳糖苷酶（lacZ）的α肽。α肽與β-半乳糖苷酶的omega段（由F'攜帶，α-互補(bǔ)）結(jié)合。當(dāng)β-半乳糖苷酶按照這種方式重新組合后能正常表達(dá)并切割X-gal生成藍(lán)斑。當(dāng)克隆DNA進(jìn)入質(zhì)粒破壞α肽基因，使得菌落為白斑。

◇   重組缺陷（recA1）：大腸桿菌（E. coli）本身具修復(fù)系統(tǒng)能重組同源序列?；蚪M克隆通常有復(fù)制區(qū)，recA介導(dǎo)的重新排列不確定，特別當(dāng)同源序列長(zhǎng)于50bp。recA功能缺失的菌株比recA⁺菌株通常更緩慢生長(zhǎng)。

◇   內(nèi)切酶I缺陷（endA1）：野生型大腸桿菌的周質(zhì)空間含非特異性內(nèi)切酶。從這些菌株中制備質(zhì)粒特別要注意質(zhì)粒被降解。endA突變?nèi)コ@個(gè)基因，顯著改善了質(zhì)粒制備物的質(zhì)粒。

◇   限制缺陷（Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：野生型大腸桿菌K12菌株含限制性內(nèi)切酶，能切割含位點(diǎn)(AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT的DNA。雖然大腸桿菌DNA自身受保護(hù)，不被同源甲基轉(zhuǎn)移酶所降解，但外源DNA會(huì)在這些位點(diǎn)被切割。限制缺陷刪減了甲基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切酶的基因。

◇   甲基限制缺陷（mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：大腸桿菌具有一套酶系統(tǒng)，mcrA，mcrB和mrr能夠切割在高等真核生物和某些植物、細(xì)菌菌株發(fā)現(xiàn)的甲基化DNA。來自PCR擴(kuò)增片段，cDNA或原先在大腸桿菌內(nèi)擴(kuò)繁的DNA不會(huì)被甲基化，也不會(huì)被切割。

◇   T1噬菌體抗性（fhuA）：T1，一種烈性噬菌體需要大腸桿菌羥肟酸鐵吸收受體用來感染。這個(gè)基因的刪減賦予對(duì)這個(gè)噬菌體的抗性，且不會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)化或細(xì)胞的生長(zhǎng)特征。

2.      Stable感受態(tài)細(xì)胞能替換Stbl2或Stbl3嗎?

答復(fù)：是的

3.      Stable感受態(tài)細(xì)胞適合大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化？

答復(fù)：是的

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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Stable化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（熱激法） Stable化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（熱激法） ?