一、骨髓瘤細(xì)胞系的選擇

    骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系有P3/X63-Ag8（X63）、P3/X63-Ag8.653（X63-Ag8.653）、P3/NSI-1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.Ul（P3Ul）、SP2/0-Ag14（SP2/0）、F0、S194/5.XXO.BU.1、MPC11-45.6TG1.7、210.RCY3.Ag1.2.3、GM15006TG-A12及U-266AR等。

    骨髓瘤細(xì)胞可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮*進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)HAT呈均一的敏感性。

    在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)均需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量一般為2×104或105細(xì)胞/孔。

二、細(xì)胞融合的步驟

    細(xì)胞融合一般包括制備飼養(yǎng)細(xì)胞層、制備免疫脾細(xì)胞、制備骨髓瘤細(xì)胞及融合等四個(gè)步驟。

    制備飼養(yǎng)細(xì)胞層時(shí)一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周后拉頸處死；浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min后用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用*注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管），反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200rpm分離5～6min后，用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml，進(jìn)行培養(yǎng)。

    制備免疫脾細(xì)胞時(shí)先將zui后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次后，將脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)后離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)后取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用。

    制備骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)取對(duì)數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心，用無血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)后取1×107細(xì)胞備用融合時(shí)先將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心后棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。在90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴作用90s。每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用。離心棄上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的選擇及抗體檢測(cè)

（1）HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 

    脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤*核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。

    在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

（2）抗體的檢測(cè)　　 

    檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。放射免疫測(cè)定（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）及免疫熒光試驗(yàn)為常用的檢測(cè)方法。

    放射免疫測(cè)定可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)；免疫熒光試驗(yàn)則適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測(cè)；其它還有間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等方法。