一、抗體的結(jié)構(gòu)與功能
1、抗原：進(jìn)入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。
    包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌、各種細(xì)胞等。
    特點(diǎn)：外源性、結(jié)構(gòu)性（分子表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)基團(tuán)作為識別位點(diǎn)）、特異性（抗原與抗體的反應(yīng)）。
2、抗體
    動物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的糖蛋白，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。
    動物脾臟有上百萬個(gè)B淋巴 細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞就是一個(gè)克隆，它針對抗原上的一個(gè)抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。
    一種抗原通常具有多個(gè)不同的抗原決定族，因此能刺激多個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。
二、單克隆抗體的制備
• 動物免疫與親本細(xì)胞的選擇
• 細(xì)胞融合：淋巴細(xì)胞雜交瘤的制備
•雜交瘤細(xì)胞的篩選：有限稀釋法等
•單克隆抗體的制備和凍存
• 單克隆抗體的純化
•親本細(xì)胞的選擇：骨髓瘤細(xì)胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT－（次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶） 。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。[小鼠骨髓瘤細(xì)胞能在體外無限增殖傳代并不分泌抗體。腫瘤細(xì)胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可被*的拮抗物—氨基喋呤(A)所阻斷(但如果培養(yǎng)基中含核苷酸“前體“次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，細(xì)胞通過另一途徑(稱替代途徑或應(yīng)急途徑)也可合成核苷酸。但后一途徑需次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶 (TK)存在)。
• 淋巴細(xì)胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。
• 免疫方法：對細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏*佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。  
•細(xì)胞融合：將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7¡ª10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG 0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。
HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞
• 細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加HAT溶液，即可加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，
• 用HAT選擇性培養(yǎng)時(shí)隔4－5天換液，8-10天后可以選擇檢測。
•HAT選擇系統(tǒng):HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。
•DNA合成途徑有兩種。1.主要途徑2.次要途徑：
• 雜交瘤技術(shù)中，常選用次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細(xì)胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細(xì)胞為親本之一。
• HPRT-細(xì)胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；
•TK- 細(xì)胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。
•含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細(xì)胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。
•淋巴細(xì)胞具有合成DNA的兩條途徑。
•雜zhong細(xì)胞通過互補(bǔ)作用獲得HRPT或TK基因，可應(yīng)用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補(bǔ)救合成途徑合成DNA。
•在HAT培養(yǎng)基中，HPRT- 或TK-  親本細(xì)胞死亡，淋巴細(xì)胞亦逐漸死亡，只有雜zhong細(xì)胞存活。
特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選
• 通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細(xì)胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞?？扇∩锨逡?，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。
•雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng):利用單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。
•在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進(jìn)雜交瘤生長的飼養(yǎng)細(xì)胞，如小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞
•或胸腺細(xì)胞等。
• 方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。
•有限稀釋法: 通過適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的目的
  1）取出陽性孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)
   2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個(gè)細(xì)胞。
  3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機(jī)率將為每孔內(nèi)落入一個(gè)細(xì)胞。
  4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過2~3天后，可觀察到有集落生長的孔，并標(biāo)記單克隆。10天左右可以檢測。
   5）根據(jù)檢測的陽性結(jié)果再次進(jìn)行克隆化。
•誘生腹水
• 將穩(wěn)定分泌單抗的細(xì)胞株，通過擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。
•方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106  雜交瘤細(xì)胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。