核酸探針標(biāo)記的實驗過程
實驗原理
分子生物研究中，zui常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
切口平移法(nick translation) 當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。zui合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細純化后的DNA。
實驗試劑
(1) 10×切口平移緩沖液: 0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)； 0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT； 100ug/ml BSA。
(2) 未標(biāo)記的dNTP原液：除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mM/L。
(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。
(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4單位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。
(5) DNA酶:1mg/ml。
(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。
(7) 10M/L NH4Ac。
實驗步驟
(1) 按下列配比混合:
未標(biāo)記的dNTP 10ul
10×切口平移緩沖液 5ul
待標(biāo)記的DNA 1ug
[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul
E.coli DNA聚合酶 4單位
DAN酶 I 1ul
加水至終體積 50ul
(2) 置于15℃水浴60分鐘。
(3) 加入5ul EDTA終止反應(yīng)。
(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5M/L, 加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
注意事項
1、3H，32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。
