染色體熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析技術(shù)，是為了了解染色體熒光原位雜交分析技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。染色體熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，其基本原理是利用被檢測(cè)的染色體上的靶DNA與所用的核酸探針（probes）間的序列同源互補(bǔ)性，經(jīng)“變性→退火→復(fù)性”，形成靶DNA與核酸探針的雜交體。核酸探針既可以直接用熒光分子標(biāo)記，也可以在先標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地gao辛，再使報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素或抗體發(fā)生免疫化學(xué)反應(yīng)，后經(jīng)熒光顯微鏡對(duì)靶DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

實(shí)驗(yàn)步驟：

[1].從體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞準(zhǔn)備的中期染色體標(biāo)本：

A.細(xì)胞的培養(yǎng)、秋水仙素處理、低滲處理、固定處理。

B.載玻片用硫suan洗液浸泡放一夜，清洗烘干，在5%APTES-乙醇溶液中60℃處理3h，取出清洗，70℃干燥備用。

C.將固定后的細(xì)胞滴于APTES修飾的載玻片上,空氣干燥。

D.脫水：70%、90%和100%乙醇脫水，每次5min，空氣干燥。注意：室溫下玻片標(biāo)本可保存數(shù)天到數(shù)周；若載玻片要長(zhǎng)期保存，應(yīng)在室溫下過(guò)夜使組織“老化”（aged），然后放入容器中，該容器密封于含干燥劑的塑料袋內(nèi)，-70℃保存。-20℃保存的玻片可在6個(gè)月內(nèi)使用；-70℃可保存一年以上；但標(biāo)本一旦溶化，則不能在此冷凍。

[2].染色體標(biāo)本變性及脫水：

A.載玻片靜置60℃烤箱孵育預(yù)熱。

B.變性液A在水浴中加熱至70℃。

C.將染色體標(biāo)本載玻片浸入變性液A中，70℃作用2min。

D.脫水：立即將載玻片依次移入冰冷的70％、90％及100％乙醇中，各保持5min。空氣干燥玻片。

[3].探針雜交液的準(zhǔn)備（10μl/片）：

A.10~20ng探針DNA和1~3μg鮭魚(yú)精DNA混合，熱塊干燥DNA。

B.DNA中加入6~7μl甲酰胺，懸浮DNA，保持30min。

C.DNA溶液中加入1μl20×SSC（終濃度2×SSC）、2μl硫suan葡萄糖（終濃度10%）、1μl250mM磷酸鈉（終濃度25mM）。保持30min。

D.75℃變性DNA探針5min。

[4].染色體標(biāo)本的雜交：

A.將10μl含變性探針的雜交液加至載玻片的變性靶DNA上。

B.在雜交液液滴上小心地蓋上18×18cm的蓋玻片，避免壓入氣泡。

C.載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃溫育放一夜。

D.雜交結(jié)束前，42℃水浴預(yù)熱漂洗液A，60℃水浴預(yù)熱漂洗液B。

E.載玻片移入42℃預(yù)熱的漂洗液A中，在42℃水浴中振蕩10min直至蓋玻片脫落。

F.載玻片移入另一份42℃預(yù)熱的漂洗液A中，振蕩5min，更換漂洗液A兩次，每次振蕩5min。

G.載玻片移入含60℃預(yù)熱的漂洗液B中，漂洗5min，更換漂洗液兩次，每次漂洗5min。

若DNA探針用熒光標(biāo)記，則無(wú)需進(jìn)行下列檢測(cè)步驟，可直接進(jìn)行顯微鏡熒光觀察。

[5].染色體標(biāo)本的檢測(cè)：

A.載玻片滴加50~200μl封閉液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內(nèi)，37℃溫育至少30min。取出載玻片，無(wú)菌水輕輕沖去蓋玻片。

B.用封閉液配制的檢測(cè)化合物溶液（1~20μg/ml）。如熒光素偶聯(lián)的鏈親和素（streptavidin），或抗地gao辛抗體（Anti-DIG-fluorescent-conjugate）溶液。

C.載玻片上滴加50μl含熒光標(biāo)記分子的檢測(cè)液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內(nèi)，37℃溫育30min，或室溫放置1h。

D.取出載玻片，無(wú)菌水輕輕沖去蓋玻片；將載玻片移入漂洗液C中，42℃振蕩漂洗3次，每次5min。

[6].將載玻片置入含復(fù)染液中，室溫振蕩20min。

[7].將載玻片移入漂洗液C中，室溫溫育1~2min。

[8].載玻片上滴加10~50μl甘油封片液，22×40mm蓋玻片覆蓋，用潔凈指甲油封閉玻片。玻片在-20℃或-70℃暗處保存數(shù)天或數(shù)月。

注意事項(xiàng)：

[1].進(jìn)行熒光物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)步驟時(shí)，采取避光措施。

[2].DAPI對(duì)人體有一定刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。

[3].原位雜交使用易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)的寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80~150bp）。

[4].原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。

[5].適復(fù)性溫度：TOR=Tm–25℃。

[6].苛刻復(fù)性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)

[7].非苛刻復(fù)性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)