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【中國儀器網(wǎng) 使用手冊(cè)】液相色譜法即HPLC屬于液相色譜法中的一種，是目前各個(gè)涉及液相色譜法行業(yè)中一種較為重要的色譜法。HPLC目前在科研中有著重要作用，一般在化工行業(yè)學(xué)科、農(nóng)業(yè)學(xué)科、醫(yī)學(xué)類學(xué)科和法檢等各個(gè)專業(yè)領(lǐng)域中起著重要的作用。在目前部分HPLC分析中，一般使用的是瓶裝純凈水和蒸餾水，但是目前這兩類水并不是超純水，因而水中還是有少量的雜質(zhì)，這類雜質(zhì)混合入配置液相和洗脫液不僅會(huì)影響HPLC的分析分析結(jié)果，還會(huì)對(duì)設(shè)備產(chǎn)生損壞。而在一般使用的水中又會(huì)又哪些物質(zhì)對(duì)水質(zhì)產(chǎn)生影響呢？而這類物質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響又有哪些呢？一般情況下顆粒、有機(jī)物、離子、膠體、微生物等會(huì)對(duì)水質(zhì)有影響并影響HPLC的分離分析結(jié)果?！　?. 水中的固體雜質(zhì)對(duì)HPLC的影響。在水質(zhì)較差的條件下，水中可能會(huì)有細(xì)微的顆粒物存在。水中的這類細(xì)微顆粒物會(huì)對(duì)儀器造成損害，不僅會(huì)損壞泵和注射器，還會(huì)堵塞色譜柱并且熔化它，這會(huì)使儀器回壓變大。除此之外，細(xì)微顆粒物會(huì)表現(xiàn)成另一種固定相，會(huì)對(duì)樣品的組成部分造成影響?！　?. 水中的有機(jī)物對(duì)HPLC的影響。一般的水質(zhì)中都會(huì)含有一些有機(jī)物存在，而在水中的有機(jī)物不僅會(huì)影響固定相的選測(cè)性以及色譜本身的基線，還會(huì)對(duì)色譜峰的分離度和積分產(chǎn)生影響，并且可能會(huì)導(dǎo)致鬼峰?！　?. 水中的微生物對(duì)HPLC的影響。在一般的水中，大部分都有微生物的存在，而微生物的存在會(huì)堵塞色譜柱，并且微生物存活的代謝產(chǎn)物會(huì)增加有機(jī)物，顆粒等垃圾，這對(duì)HPLC的影響上述兩點(diǎn)已經(jīng)說明?！　?. 水中的一些離子對(duì)HPLC的影響。在水中存在大量的陰陽離子，其中有一些會(huì)吸收UV(紫外線)的離子會(huì)對(duì)峰產(chǎn)生影響，而另一些有腐蝕性離子會(huì)損壞高壓等配件，降低其使用壽命，并且離子濃度的改變會(huì)影響HPLC的分離分析結(jié)果?！　?. 水中的膠體對(duì)HPLC的影響。在水中存在的各類物質(zhì)容易形成膠體，而膠體會(huì)不可逆的吸附在固定相上面，從而對(duì)色譜柱的分離分析結(jié)果產(chǎn)生影響?！　∧敲词褂檬裁此拍鼙M可能排除掉這些影響呢？超純水便是一個(gè)很好的選擇，超純水的制作過程綜合了反滲透、離子交換、活性炭吸附、膜過濾、超濾及紫外光氧化等多種純化工藝，從而使超純水的水質(zhì)盡可能達(dá)到無雜質(zhì)，所以超純水可以盡可能排除上述影響因素，是HPLC的合適選擇。 有關(guān)液相色譜儀的系統(tǒng)組成介紹

液相色譜儀系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。

儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相；

被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)；

在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別；

被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀；

數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；

下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。

進(jìn)樣系統(tǒng)

一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。

這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。

輸液系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。

高壓泵的一般壓強(qiáng)為47～44X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí)；

可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度；

這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。

流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變；

包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。

這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。

分離系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。

色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管）；

內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成；

住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。

固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成；

它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)；

加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）；

或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。

因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。

例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。

基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。

根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。

這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。

再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C；

通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。