人胎兒纖連蛋白（fFN）ELISA試劑盒操作步驟

1、待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl，每種樣品設(shè)3個平行孔;設(shè)兩個陰性對照孔，每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設(shè)一個空白對照孔，加入純細胞裂解液100μl。

2、酶標板置4℃，包被過夜。

3、洗板：吸干孔內(nèi)反應液，用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后，即甩去)，之后將洗滌液注滿板孔，浸泡1-2分鐘，間歇搖動。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。

4、陰性對照孔每孔加入PBS 50μl，樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。

5、酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。

6、洗板，同(4)。

7、每孔加1:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。

8、酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)，孵育60min。

9、洗板，同(4)。

10、每孔加TMB顯色液 100μl，輕輕混勻10s，置37℃暗處反應15-20min。

11、每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。

12、分別測450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui終測得的OD值為兩者之差(W1-W2)，以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

13、數(shù)據(jù)處理：在得出標本(S)和陰性對照(N)的 OD值后，計算S/N值。S/N≥2.1為陽性判定標準。

樣本保存

1、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3、細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5、保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。