硝基呋喃類藥物的危害及檢測目的

硝基呋喃類藥物常見的有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林4種。硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，對一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲具有抑制和殺滅作用，且價格低廉，通常被用于預防和治療畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中因感染沙門氏菌和大腸埃希菌而產(chǎn)生的疾病。然而，硝基呋喃類藥物具有潛在的致畸、致癌、致突變作用，其濫用會造成動物體內獸藥殘留，危害食用人群的身體健康。2020年我國農業(yè)農村部公告第250號，也將硝基呋喃類藥物列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

本文闡述了如何將硝基呋喃類藥物代謝物從樣品基質中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉化成液質聯(lián)用儀可以檢測的形式。以酸解、衍生、提取、凈化為重點，依據(jù)國標GB/T 21311-2007，為檢測人員和相關領域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：硝基呋喃類藥物代謝物

應用范圍：動物源性食品/肌肉/內臟/魚/蝦/蛋/奶/蜂蜜/腸衣

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

方法原理：樣品經(jīng)鹽酸水解，鄰硝基苯（甲醛）過夜衍生，調pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化。分析物采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜定性檢測，采用穩(wěn)定同位素內標法進行定量測定。

前處理儀器：組織搗碎機；分析天平（感量0.0001g和0.01g）；均質器（10000 r/min）；振蕩器；恒溫箱；pH計（測量精度±0.02 pH單位）；離心機（10000 r/min）；氮吹儀；旋渦混合器；容量瓶（1 L，100 mL，10 mL）；具塞塑料離心管（50 mL）；刻度試管（10 mL）；移液槍（5 mL，1 mL,100 μL）。

檢測儀器：HPLC-MS/MS+ESI源

試樣制備

1.肌肉、內臟、魚和蝦

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，用組織搗碎機充分搗碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標明標記。將試樣置于-18 ℃冷凍避光保存。

2.腸衣

從原始樣品取出有代表性樣品約100 g，用剪刀剪成邊長<5 mm的方塊，混勻后均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標明標記。將試樣置于-18 ℃冷凍避光保存。

3.蛋

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，去殼后用組織搗碎機攪拌充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標明標記。將試樣置于4 ℃冷藏避光保存。

4.奶和蜂蜜

從原始樣品取出有代表性樣品約500 g，用組織搗碎機充分混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣，密封，并標明標記。將試樣置于4 ℃冷藏避光保存。

前處理方法

1.水解和衍生化

肌肉、內臟、魚、蝦和腸衣

稱取約2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，體積比），振蕩10 min后，以4000 r/min離心5 min，棄去液體。殘留物中加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸，用均質器以10000 r/min均質1 min后，再依次加入混合內標標準溶液100 μL，鄰硝基苯（甲醛）溶液100 μL，渦動混合30 s后，再振蕩30 min，置37 ℃恒溫箱中過夜（16 h）反應。

蛋、奶和蜂蜜

稱取約2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L鹽酸（以樣品*浸潤為準），用均質器以10000 r/min均質1 min后，再依次加入混合內標標準溶液100 μL，鄰硝基苯（甲醛）溶液100 μL，渦動混合30 s后，再振蕩30 min，置37 ℃恒溫箱中過夜（16 h）反應。

2.提取和凈化

取出樣品，冷卻至室溫，加入1 mL～2 mL 0.3 mol/L磷酸鉀（1 mL鹽酸溶液加0.1 mL磷酸鉀溶液），用2.0 mol/L氫氧化鈉調pH 7.4（±0.2）后，再加入10 mL～20 mL乙酸乙酯（乙酸乙酯加入體積與鹽酸溶液體積一致），振蕩提取10 min后，以10000 r/min離心10 min，收集乙酸乙酯層。殘留物用10 mL～20 mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯層。收集液在40 ℃下用氮氣吹干，殘渣用1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，再用3 mL乙腈飽和的正己烷分兩次液液分配，去除脂肪。下層水相過0.20 μm微孔濾膜后，取10 μL供儀器測定。

3.混合基質標準溶液的制備

肌肉、內臟、魚、蝦和腸衣

稱取5份約2 g的陰性試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL甲醇-水混合溶液（1+1，體積比），振蕩10 min后，以4000 r/min離心5 min，棄去液體。殘留物中加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸，用均質器以10000 r/min均質1 min后，按照定容濃度：1、5、10、50、100 ng/mL，分別加入混合中間標準溶液或混合標準工作溶液，再加入混合內標標準溶液100 μL，余下操作同肌肉、內臟、魚、蝦和腸衣的衍生、提取和凈化步驟。

蛋、奶和蜂蜜

稱取5份約2 g的陰性試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL～20 mL 0.2 mol/L鹽酸（以樣品*浸潤為準），用均質器以10000 r/min均質1 min后，按照定容濃度：1、5、10、50、100 ng/mL，分別加入混合中間標準溶液或混合標準工作溶液，再加入混合內標標準溶液100 μL，余下操作同蛋、奶和蜂蜜的衍生、提取和凈化步驟。

國標解讀及注意事項

1.由于硝基呋喃類藥物進入動物體內后，會快速轉化成為對應的代謝物，且代謝物穩(wěn)定、殘留時間長、毒性更強，因此動物源性食品中都以檢測硝基呋喃類代謝物為主。動物飼料中才會檢測硝基呋喃類原藥。

2.由于硝基呋喃類代謝物見光容易分解，所以在樣品制備和前處理過程中盡量避光操作。

3.由于硝基呋喃類代謝物的分子質量比較小，需要*行衍生化反應，增加分子質量，從而提高質譜檢測靈敏度。

4.硝基呋喃類代謝物和蛋白質結合緊密，需要酸解使其游離出來，同時進行衍生化反應。

5.特殊基質蝦干、海米等，pH值比較高，在酸解過程中適當提高鹽酸濃度，保證酸解效果；帶有裹粉類的食品，在生產(chǎn)和加工過程中會產(chǎn)生SEM，甲醇水洗滌后仍會有殘留，容易造成假陽性結果，在結果判定時需要注意這個問題。

6.由于硝基呋喃類代謝物檢測的特殊性，需要制作基質加標流程曲線進行定量分析。在陰性試樣中，根據(jù)定容濃度加入相應的外標，其余操作同樣品前處理方法一致。

7.在建立液質聯(lián)用檢測方法時，需要用到硝基呋喃類代謝物衍生后的四種標準物質，以及相對應的四種同位素內標。

參考文獻

GB/T 21311-2007 動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質譜法

圖1 肌肉、內臟、魚、蝦和腸衣中硝基呋喃類代謝物殘留量測定的前處理流程圖

圖2 蛋、奶和蜂蜜中硝基呋喃類代謝物殘留量測定的前處理流程圖

 表1  硝基呋喃類代謝物信息表