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聚合酶鏈?zhǔn)剑?PCR)反應(yīng)特異性增強(qiáng)方法

2024-10-9  閱讀(34)

  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn),是能將微量的DNA大幅增加。PCR反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、快速簡便、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。
 
  PCR 反應(yīng)特異性增強(qiáng)方法:
 
  1. 引物的設(shè)計(jì)
 
  引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì),長度 15-30bp,GC 含量小于 60%,3’端不超過連續(xù)三個(gè) G 或 C,堿基分。
 
  布錯(cuò)落有致,避免引物自身形成二聚體,設(shè)計(jì)完成之后,需進(jìn)行 BLAST 檢測,如果與其他基因不具有互補(bǔ)性,則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
 
  2. 降落 PCR
 
  降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR,最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí),同時(shí)又可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度,退火溫度過高會使 PCR 效率過低,過低則會使非特異擴(kuò)增過多。這雖然可以通過反復(fù)嘗試來優(yōu)化,但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落 PCR 提供了一個(gè)較為簡易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴(kuò)增,此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低,但非特異擴(kuò)增基本沒有。隨著退火溫度的降低,非特異擴(kuò)增會逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量優(yōu)勢,因此會對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競爭抑制,從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。
 
  3. 熱啟動(dòng)擴(kuò)增
 
  采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行擴(kuò)增,是除了設(shè)計(jì)最佳引物之外,提高 PCR 反應(yīng)特異性好的方式。在一般的 PCR 反應(yīng)中,試劑的配置需在冰上進(jìn)行,且要將 PCR 儀預(yù)熱,這種方法就類似于熱啟動(dòng),能夠一定程度的抑制錯(cuò)配。但是酶在低溫下也存在活性,只要體系中有 DNA 鏈存在,就會擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動(dòng)的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性,而zui有效的方法就是使用熱啟動(dòng) Taq 酶(或熱啟動(dòng)高保真聚合酶)去擴(kuò)增,它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心,當(dāng)溫度上升到 95℃時(shí)恢復(fù)活性,指導(dǎo)擴(kuò)增。
 
  4. 巢式 PCR
 
  采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增,在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是,它采用兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增,首先用第一對引物普通 PCR,然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴(kuò)增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
 


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