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酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測顯色與比色陳述

2024-12-2  閱讀(41)

  酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。它是應用最多的一種免疫酶技術。ELISA檢測是一種免疫檢測方法,通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原,包括蛋白質或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣,它們依靠抗體與目標的結合來促進檢測。
 
  一、顯色
 
  ELISA試劑盒里的顯色液A和B成分:
 
  如果你是HRP的二抗,顯色液A、B的成分一般是H2O2和TMB(或OPD),至于具體A是那一個B是那一個你要看說明書。
 
  HRP催化過氧化物H2O2,其反應式如下:D=TMB(或OPD)
 
  DH2+ H2O2= D+2H2O
 
  上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經(jīng)酶作用后成為有色的產物,以便作比色測定。
 
  顯色是ELISA中的后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。
 
  適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間,及時判斷。
 
  OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
 
  TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時后即可*消退至無色。
 
  TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
 
  二、比色
 
  比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96孔的座架中,才可進行比色。
 
  在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。
 
  其后可用空白孔以蒸餾水校零點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進行計算。
 
  比色結果的表達以往通用光密度(oplical density,OD),現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是,將吸收波長寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長為492nm,表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
 


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