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ELISA檢測試劑盒實驗夾心法具體過程

2025-2-10  閱讀(11)

  實驗開始前,各試劑和樣本均應(yīng)平衡至室溫;樣本復(fù)融后需再次離心,取上清檢測;試劑或樣本配制時,需充分混勻并盡量避免起泡;標(biāo)曲和樣本建議做復(fù)孔檢測。
 
  1. 加樣:將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中,每個濃度的工作液并列加兩孔,每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔,每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍,需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標(biāo)板覆膜,37℃孵育90分鐘。提示:加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內(nèi)。
 
  2. 生物su 化抗體/抗原:棄去液體,甩干,不用洗滌。每個孔中立即加入生物su 化抗體/抗原工作液100 μL,混勻,酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃孵育1小時。
 
  3. 洗滌:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加洗滌液350 μL,浸泡1-2分鐘,吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示:此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī)。每一步洗滌充分是實驗的根本。
 
  4. HRP酶結(jié)合物:每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL,混勻,加上覆膜,37℃孵育30分鐘。
 
  5. 洗滌:棄去孔內(nèi)液體,洗板5次,方法同步驟3。
 
  6. 底物:每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,混勻,加上覆膜,37℃避光孵育15分鐘左右。提示:根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長孵育時間,但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時,即可終止。
 
  7. 終止:每孔加終止液50 μL,終止反應(yīng)。提示:終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。
 
  8. 讀值:立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱,設(shè)置好檢測程序。
 
  9. 實驗完畢后,將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。
 


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