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cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒利用真核生物的各種組織或細(xì)胞中的Poly（A）+ RNA合成cDNA，然后進(jìn)行基因克隆，這在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。這一技術(shù)的使用，使基因的結(jié)構(gòu)解析及目的蛋白的表達(dá)等變得更為方便。一般合成cDNA以及構(gòu)建cDNA Library的方法為： ① 合成與目的Poly（A）+ RNA相互補(bǔ)的雙鏈cDNA；② 將雙鏈cDNA與細(xì)菌或病毒來(lái)源的載體進(jìn)行重組； ③ 將重組體導(dǎo)入細(xì)菌或
cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒
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cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒 | 5次 | 詢價(jià) |
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利用真核生物的各種組織或細(xì)胞中的Poly(A)+ RNA合成cDNA，然后進(jìn)行基因克隆，這在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。這一技術(shù)的使用，使基因的結(jié)構(gòu)解析及目的蛋白的表達(dá)等變得更為方便。一般合成cDNA以及構(gòu)建cDNA Library的方法為： ① 合成與目的Poly(A)+ RNA相互補(bǔ)的雙鏈cDNA；② 將雙鏈cDNA與細(xì)菌或病毒來(lái)源的載體進(jìn)行重組； ③ 將重組體導(dǎo)入細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增， 構(gòu)建cDNA Library。構(gòu)建成的cDNA Library可以用于cDNA的解析，或者進(jìn)一步進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄或體外翻譯等。本試劑盒是以動(dòng)植物由來(lái)的Poly(A)+ RNA為模板合成雙鏈cDNA后，將雙鏈cDNA與Plasmid Vector進(jìn)行重組，構(gòu)建質(zhì)粒cDNA Library的試劑盒。試劑盒中使用的載體pAP3neo含有SV40啟動(dòng)子，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá) 具有下列特點(diǎn)：
1. 操作簡(jiǎn)便：使用Ready-to-Use型試劑。
2. 高靈敏度：能夠高靈敏度地檢出凋亡細(xì)胞的片斷化DNA。
3. 高特異性：抑制完整的染色體DNA的混入，選擇性地提取斷片化DNA。
4. 快速操作：整體操作約需2.5小時(shí)。
5. 定 量 性： 與熒光色素組合可以對(duì)片斷化DNA進(jìn)行定量。
6. 安 全 性： 不使用苯酚等。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層(無(wú)色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
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