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脲酶(UE)試劑盒,微板法

脲酶(UE)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 脲酶（Urease，UE）測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2140W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 脲酶（UE，EC 3.5.1.5）是一種含鎳的寡聚酶，特異性地催化尿素水解釋放出氨和二氧化碳。脲酶活性 與有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)，反應(yīng)了氮素狀況。 本試劑盒利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素產(chǎn)生的 NH3-N，其在強(qiáng)堿性介質(zhì)中與次氯酸鹽和*酚反 應(yīng)，生成水溶性染料靛酚藍(lán)，其深淺與溶液中的 NH3-N 含量呈正比，該物質(zhì)在 578nm 有光吸收，其 深淺與溶液中的 NH3-N 含量呈正比，進(jìn)而得出脲酶活力大小。 二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 110 mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 g×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部，再加 入 5mL 蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑 4℃保存。 試劑三 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 避光保存。 試劑四 液體 3mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 A：液體 3.5mL×2 瓶 B：液體μL×1 支 4℃保存 臨用前取 30μL 的 B 液進(jìn)一瓶 A 液中，混勻后作為 試劑五使用?；靹蚝蟮脑噭┪逡恢軆?nèi)用完。 標(biāo)準(zhǔn)品 液體 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、脲酶（UE）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰浴 勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 578nm。 ② 在 EP 管依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本上清液 20 20 試劑一 190 190 試劑二 90 蒸餾水 90 混勻，放入 40℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中孵育 1 小時(shí)。 ③ 顯色反應(yīng)：在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 ②步反應(yīng)混合液 15 15 蒸餾水 45 45 試劑三 60 60 試劑四 30 30 試劑五 60 60 混勻，37℃放置 20min 后，于 578nm 讀取吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 試劑三和四和五需分開加，不能事先混合。 2. 若ΔA 值較小，可增加取樣質(zhì)量 W（如 0.2g 或更多）或在②步中增加樣本加樣體積 V1（如增至 50μL，則試劑一相應(yīng)減少），或在③步顯色反應(yīng)階段增加上清液量 V2(如增至 30μL，則蒸餾水體 積相應(yīng)減少)；則改變后的 W 和 V1 和 V2 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若 A 測(cè)定值大于 1.5，可在③步階段減少上清液量 V2(如減至 5μL，則蒸餾水體積相應(yīng)增加)；或 用蒸餾水稀釋③步檢測(cè)用到的上清液，則改變后的 V2 和稀釋倍數(shù) D 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.4197x - 0.0051；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（μg），y 為吸光值ΔA 。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1μg 的 NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。 脲酶(UE)活力(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0051)÷2.4197]×(V3÷V2)÷(V1×Cpr)÷T×D =6.9×(ΔA+0.0051)÷Cpr×D 3、按樣本鮮重計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1μg 的 NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。 脲酶(UE)活力(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0051)÷2.4197]×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =6.9×(ΔA+0.0051)÷W×D 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1μg 的 NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。 脲酶(UE) (μg/min/104 cell)=[(ΔA+0.0051)÷2.4197]×(V3÷V2)÷(500×V1÷V)÷T×D =0.014×(ΔA+0.0051)×D 5、按液體體積計(jì)算: 酶活定義：每毫升液體每分鐘產(chǎn)生 1μg 的 NH3-N 定義為一個(gè)酶活力單位。 脲酶(UE)活力(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0051)÷2.4197]×(V3÷V2)÷V1÷T×D=6.9×(ΔA+0.0051)×D V---提取液體積，1mL； V1---②步反應(yīng)體系中樣本加樣體積，0.02mL； V2---③步顯色階段上清液體積，0.015mL； V3---②步反應(yīng)總體積，0.3mL； T---反應(yīng)時(shí)間，60min；W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞數(shù)量； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1. 把標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL），用蒸餾水稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0,4,8,12,16,20. μg/mL。也可 根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 2. 在③步顯色反應(yīng)階段，按照測(cè)定管加樣表操作，依據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。