三磷酸腺苷（ATP）在細胞能量，代謝調(diào)節(jié)和細胞信號傳導中起著基本作用。ATP的定量可用于多種生物學應用。因為ATP是幾乎所有活生物體的能量來源，但在沒有活生物體的情況下會迅速降解，因此它的存在可以用來確定活生物體的存在。ATP的測量已用于細胞的細胞毒性，表面細菌的檢測，水中細菌的定量，培養(yǎng)物中的體細胞和食品質(zhì)量。McElroy*提出使用螢火蟲生物發(fā)光法測量ATP，當時他發(fā)現(xiàn)ATP對于產(chǎn)生光至關重要。螢火蟲螢光素酶是一種單體的61 kD酶，可催化螢光素的兩步氧化，產(chǎn)生560 nm的光。di一步涉及通過ATP激活蛋白質(zhì)，以生成反應性混合酸酐中間體。在第二步中，活性中間體與氧氣反應生成瞬態(tài)二氧雜環(huán)丁烷，該瞬態(tài)二氧雜環(huán)丁烷迅速分解為氧化產(chǎn)物氧化熒光素和二氧化碳以及一束光。當ATP是限制性成分時，光強度與ATP濃度成正比。因此，可以使用光度計將光強度的測量結(jié)果用于定量ATP。AAT Bioquest的ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑盒（不含DTT）以即用形式提供了所有必需成分。它提供了一種快速，簡單且均一的發(fā)光測定法，用于監(jiān)測哺乳動物細胞中的細胞增殖和細胞毒性。該測定法是基于螢火蟲熒光素酶對ATP和熒光素的催化釋放而進行的ATP檢測。它可以在化學發(fā)光酶標儀上以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行。該測定法極其靈敏，每孔可檢測50個細胞。它具有穩(wěn)定的發(fā)光信號，半衰期超過2小時。此ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑盒不使用DTT，從而消除了難聞的氣味。

1. 用測試化合物（100 µL / 96孔板或25 µL / 384孔板）制備細胞（樣品）
2. 加入等體積的即用型ReadiUse™快速光度ATP分析試劑（100 µL / 96孔板或25 µL / 384孔板）
3. 在室溫下孵育10-20分鐘
4. 監(jiān)控發(fā)光強度

重要說明
為了獲得*效果，強烈建議使用白板。開始實驗前，在室溫下解凍所有試劑盒的成分。

配制標準溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

可選，不提供ATP。

用ddH2O或適當?shù)木彌_液制備1 mM ATP儲備溶液，然后進行系列稀釋以達到10 pM至10 µM的ATP濃度。

程序

表1.白色96孔微孔板中ATP標準品和測試樣品的布局。SD = ATP標準液，BL =空白對照，TS =測試樣品

表2.  每個孔的試劑組成

1. 通過在所需的化合物緩沖液中加入10 µL的10X化合物（用于96孔板）或5 µL的5X化合物（用于384孔板）來用測試化合物處理細胞（或樣品）。對于空白孔（沒有細胞的培養(yǎng)基），添加相應量的化合物緩沖液。

2. 孵育細胞板在37 ^ø C，5％CO ₂培養(yǎng)箱中的所需時間，如24，48或96小時。

3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的ReadiUse™快速光度ATP分析試劑。
    
4. 在室溫下孵育10-20分鐘。注意： 將未使用的ReadiUse™快速發(fā)光ATP分析試劑分裝并儲存在-20 ^o C，并避免重復的冷凍/解凍循環(huán)。

4. 使用標準發(fā)光計監(jiān)控發(fā)光強度。

數(shù)據(jù)分析

4e+42e+48.0e+36.0e+34.0e+32.0e+3- 2 hr- 15 minData legendGenerated with Quest Graph™Cell (#/well)RLUX: 2.13e+3Hover mouse to interactY: 1.3e+4Y: 1.3e+4Y: 1.1e+4Y: 1.1e+4

從空白標準孔獲得的讀數(shù)（RLU）用作陰性對照。從其他標準的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標準讀數(shù)，以獲得標準曲線和方程式。該方程式可用于計算細胞樣品