監(jiān)測細胞增殖是評估細胞活力，細胞周期和遺傳毒性的zui可靠方法之一。檢測細胞增殖的一種基本方法是在細胞生長的S期過程中，在存在胸腺嘧啶核苷的情況下測量DNA合成。Bucculite™dU摻入細胞增殖測定試劑盒使用FOL-dU（胸苷的類似物）。FOL-dU在DNA合成過程中被摻入細胞DNA中。固定細胞后，通過我們的Buccutite™標記技術(shù)用MTA-iFluor™488標記摻入的FOL-dU。在FITC通道中可視化細胞中形成的iFluor™488標記的DNA。Bucculite™dU摻入細胞增殖試劑盒提供了基于抗BrdU抗體的檢測和EdU點擊化學(xué)檢測的替代方法。

協(xié)議摘要

1. 準備細胞（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）
2. 對于96孔板，以100 µL /孔添加2X FOL-dU工作溶液
3. 在37ºC下孵育3小時
4. 取出培養(yǎng)基，并在室溫下用100µL冰冷的90％甲醇的PBS溶液固定細胞15分鐘
5. 除去固定液并用PBS洗滌3次
6. 加入1X iFluor™488-MTA工作溶液（100 µL /孔）并在室溫下染色30分鐘。
7. 除去每個孔中的工作溶液，并用1X洗滌緩沖液洗滌細胞3次。
8. 加入100µL 1X洗滌緩沖液/孔，并用FITC濾光片組觀察紫外熒光顯微鏡。

重要說明
使用前，請在室溫下解凍所有組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. FOL-dU儲備溶液（1000X）：
將500 µL DMSO（組分E）添加到FOL-dU（組分A）中制成1000X儲備溶液。注意：此1000X濃度是使用具有*FOL-dU濃度的HeLa細胞開發(fā)的。生長培養(yǎng)基，細胞密度，細胞類型變化和其他因素可能會影響標記。我們建議測試一系列FOL-dU濃度，以確定適合您的細胞類型和實驗條件的*濃度。

2. iFluor™488-MTA儲備溶液（400X）：
將50 µL DMSO（組分E）添加到iFluor™488-MTA（組分B）中，制成400 X iFluor™488-MTA儲備溶液。

準備工作溶液

1. 2X FOL-dU工作解決方案

在*培養(yǎng)基中將1000X FOL-dU儲備溶液稀釋500倍，以制備2X FOL-dU工作溶液。

2. 1X iFluor™488-MTA工作解決方案

將2.5 µL 400X iFluor™488-MTA儲備溶液添加到1mL染色緩沖液（組分C）中，以制備1X iFluor™488-MTA工作溶液。

3. 1X洗滌緩沖液

向9mL PBS中加入1mL 10X洗滌緩沖液（組分D），制成1X Washing Buffer。 

程序

準備細胞

1. 對于貼壁細胞：將細胞在生長培養(yǎng)基中以10,000至40,000個細胞/孔/ 100 µL（對于96孔板）過夜，以2,500至10,000個細胞/孔/ 20 µL（對于384孔板）過夜。
    
2. 對于非貼壁細胞：離心培養(yǎng)液中的細胞，并將細胞沉淀以1-2 X 106細胞/ ml（對于10個96孔板為10 mL）懸浮在培養(yǎng)液中。注意：應(yīng)單獨評估每個細胞系，以確定*細胞密度。

用FOL-dU標記細胞

1. 將等體積的2X FOL-dU工作溶液添加到包含要處理的細胞的培養(yǎng)基中，以在每個孔中獲得1X FOL-dU溶液。我們不建議更換所有培養(yǎng)基，因為這可能會影響細胞增殖速率。
    
2. 在細胞類型的條件下將細胞孵育3小時。FOL-dU暴露于細胞的時間可以直接測量合成DNA的細胞。孵育時間取決于細胞生長速率。

細胞固定

1. 孵育后，移去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入100µL冰冷的PBS中的90％甲醇（未提供，甲醇/ PBS，v / v為90/10），并在室溫下孵育15分鐘。
    
2. 除去固定緩沖液，并用PBS清洗每個孔中的細胞兩次。

染色細胞

1. 在細胞板中加入100 µL /孔（96孔板）或50 µL /孔（384孔板）的1X iFluor™488-MTA工作溶液。在避光條件下，于室溫下將細胞與工作溶液孵育30分鐘。
    
2. 除去每個孔中的工作溶液。
    
3. 用1X洗滌緩沖液洗滌細胞3次，洗滌后每孔加入100µL洗滌緩沖液。注意：如果需要Hoechst 33342染色劑，請在1X洗滌緩沖液中制成5-10 µg / ml Hoechst 33342溶液并染色30分鐘。
    
4. 使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡觀察細胞中的熒光信號。

   22305	Bucculite™dT摻入細胞增殖熒光成像試劑盒*綠色熒光*	Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Green Fluorescence*	200 Tests
   22315	Bucculite™dT摻入細胞增殖熒光成像試劑盒*紅色熒光*	Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Red Fluorescence*	200 Tests
   22320	Bucculite™dT摻入細胞增殖熒光成像試劑盒*深紅色熒光*	Bucculite™ dT Incorporation Cell Proliferation Fluorescence Imaging Kit *Deep Red Fluorescence*	200 Tests
   22400	Cell Meter™ 細菌活性檢測試劑盒	Cell Meter™ Bacterial Viability Assay Kit	200 Tests
   22401	MycoLight™ 比率法細菌膜電位試劑盒 *紅色/綠色熒光*	MycoLight™ Ratiometric Bacterial Membrane Potential Kit *Red/Green Fluorescence*	200 Tests